mirad lo que he encontrado es del blog de una biologa española expatriada en suiza, si lo que dice es cierto la tenemos liada parda
¿Cómo funciona la famosa prueba que hacen para saber si tienes ébola? | Ablogios
Mucha gente me ha estado preguntando sobre cómo se sabe si alguien tiene ébola, cuánto tarda la prueba, en qué consiste… Voy a intentar contestar a esas preguntas. Una vez más, y antes de empezar, quiero aclarar que lo voy a explicar a un nivel muy básico para que todo el mundo lo entienda. Para aquellos que podáis tener preguntas más avanzadas, sabéis que siempre me podéis preguntar, pero yo quiero escribir algo que la vecina del quinto, que no sabe lo que es el DNA sepa cómo funciona.
Habréis leído en los periódicos que se hace una PCR. ¿Pero eso que es? La PCR es la reacción en cadena de la polimerasa. Supongo que no ha aclarado mucho. Más o menos cuando yo nací, a un señor se le ocurrió como usar una polimerasa para hacer copias de DNA, o ADN como se le suele llamar en español. Hasta el momento se sabía que había unas proteínas, llamadas polimerasas, que hacían copias del DNA. El problema era cómo conseguir repetir el proceso muchas veces, porque para que esto funcione hace falta desplegar el DNA, y para eso hace falta calor, y estas proteínas no funcionan bien con el calor. Para vuestra siguiente pregunta, que va a ser que cómo se hace entonces en nuestras células, diré que es que nosotros tenemos otras muchas proteínas que ayudan en el proceso. Pero en un laboratorio queremos usar sólo una. Así a ese señor se le ocurrió coger la proteína de una bacteria termófila, que vive a temperaturas muy altas, y probar a ver si funcionaba. Y funcionó. Hoy en día tenemos una gran variedad de polimerasas de diferentes organismos, todos ellos termófilos, y que cada vez funcionan más rápido.
Lo que hay que hacer es poner en un tubo el DNA que quieres copiar, la polimerasa, dNTPs (son los nucleótidos, las “letras” que componen el DNA, y que la polimerasa va a ir eligiendo y uniendo a la cadena) y unos primers (cebadores) que son cadenas cortas que le sirven a la polimerasa para empezar a copiar. Estas cadenas son complementarias a los extremos de la zona que se quiere copiar, y sirven como inicio, porque la polimerasa no es capaz de empezar por cualquier sitio, necesita un pequeño trozo de cadena doble, y lo que hace es unirse al extremo e ir añadiendo letras a la cadena, copiando el molde, que es nuestro DNA de inicio. Así, tras varios ciclos, conseguimos millones de copias de algo de lo que teníamos muy poco. Para ello solo hay que ir calentando mucho (para que el DNA se despliegue), enfriando un poco (para que los primers se unan pero el DNA original no) y dejando un tiempo más o menos largo según el trozo de DNA que se quiera copiar. Esto se repite muchas veces hasta tener copias suficientes, y se hace en una máquina llamada termociclador (porque hace ciclos de calor…) en un tubo muy pequeño, con un volumen de unos 50 microlitros (una gota, vaya) y tardas entre una y tres horas según el DNA que quieras copiar y lo rápida que sea la polimerasa que uses.
Ahora volvamos al ébola. Yo os he explicado como se copia DNA, pero es que el ébola dicen en la tele que es un bichito de RNA… ¿Entonces? Efectivamente, el ébola es un bichito RNA, y tiene una única cadena, de polaridad negativa, para ser más exactos. Como para la PCR necesitamos DNA, lo que se hace es copiar primero el DNA a RNA. Esto lo hace otra proteína, que se llama transcriptas a inversa. La transcripción es el proceso por el cual el DNA se copia a RNA mensajero, que luego se va a utilizar para hacer proteínas. Cuando se descubrió la proteína que hacia lo contrario, pasar el RNA a DNA (en este caso se le llama cDNA, por complementario), se la llamó transcriptasa inversa. Esta reacción es mucho más sencilla porque necesitamos hacerla solo una vez, para tener un molde para la PCR.
Ahora vamos a la prueba que se hace. He intentado encontrar toda la información posible pero el gobierno de España no aporta demasiada información. El de Estados Unidos sí, así que os voy a contar el kit que usan ellos, que aunque a España nos lo pueda estar proporcionando otra compañía, funciona igual.
El kit que ha aprobado el gobierno de los Estados Unidos para la prueba es, ante todo, un agujero oscuro de información. Por supuesto, no te cuentan que lleva cada tubo que te venden, porque entonces no lo comprarías. Pero la información disponible es suficiente para que nos hagamos una idea.
Lo primero, el kit funciona a partir de una gota de sangre. Sólo necesitas una gota, y te permite detectar el bichito incluso antes de que se muestren síntomas. Tengamos en cuenta esto, porque es un factor muy importante, ya que a nosotros nos están contando que si no hay síntomas no hay bichito suficientes, pero eso es mentira. No es que los vayan a detectar a los cinco minutos de la infección, pero podría ser de ayuda detectarlo el día anterior a mostrar síntomas, para poder aislar lo antes posible.
El primer paso para el análisis es inactivar el bichito. Así, su RNA va a seguir intacto, pero el bichito ya no puede infectar al pobre científico que hace el análisis. Pese a ello, te repiten mil veces que lo hagas en un laboratorio con el nivel de seguridad adecuado. A continuación usas otro kit (uno muy común, que casi los que hemos trabajo con RNA hemos usado) para extraer el RNA. Funciona a base de romper las células y los bichito y dejar suelto el material genético (DNA y RNA), se elimina el DNA, y el RNA se une a una resina en una minicolumnita, luego se lava para quitar lo que no se interesa y se eluye con agua o un buffer (tampón) en el que se maximiza la estabilidad.
La muestra de RNA obtenida es la que se usa para la PCR. El kit permite hace un “todo en uno” de forma que en el mismo tubo primero dejas que la transcriptasa inversa copie el RNA a DNA y después que la polimerasa haga copias. Además, funciona con la tecnología conocida como Taqman (algo que yo nunca he tenido el placer de usar) de forma que se usan unos primers que llevan una etiqueta que cuando se hace una copia emite fluorescencia. Así, al utilizar un termociclador que lleva un detector, puedes ir viendo en tiempo real cuantas copias se hacen, lo que además te permite calcular cuánto DNA tenias y por extensión cuántos bichito había (a ojo, que aquí estamos hablando de decir si había billones o solo millones). Esto además permite ahorrar tiempo en visualizar la muestra tras la reacción, lo que los mortales que no tenemos acceso a eso hacemos cargando las muestras en un gel de agarosa que teñimos con un agente que se intercala entre el DNA y que brilla con luz ultravioleta (y que es altamente cancerígeno, dicen). Nosotros lo que hacemos es aplicar una corriente eléctrica, usar un marcador y ver el tamaño del DNA que se ha copiado, para ver si tiene el tamaño de lo que nosotros queríamos copiar (si hay banda y tiene el tamaño correcto, es que si). Con el sistema que usa el kit, en la pantalla del ordenador ves una curva en la que además de presencia o ausencia puedes ver cantidad.
Por supuesto, y que nadie lo dude, todo kit lleva sus controles. Los controles asegurar que todos los reactivos funcionen, que la muestra haya sido obtenida correctamente (para eso se mira la presencia de RNA humano), que la máquina no haya fallado… Vamos, es casi imposible que falle y no lo detectes en los controles. Por supuesto, siempre puede haber errores, y por eso la prueba se repite (cada vez que se hace la prueba se hacen varias, y se repiten al día siguiente).
En conjunto, desde la extracción de la sangre hasta obtener el resultado, dependiendo siempre de la agilidad en el traslado de muestras y la agilidad del científico trabajando con el supertraje de seguridad… No se debería tardar más de seis horas en obtener el resultado.
¿Y que miramos exactamente? Podría decir que miramos si había RNA del bichito del ébola y dejarlo ahí, pero sería poco específica. El kit no especifica que es lo que amplifica en el RNA. Yo, y esto es mi suposición, asumo que se amplifica el gen de la nucleoproteína, o al menos un trozo del mismo. Lo supongo porque es la proteína más abundante y la más conservada, por lo cual entiendo que es la mejor diana para detectar el bichito, pero no hay información disponible, y supongo que está protegido por patentes. Sí puedo decir que la mayor parte de estudios publicados sobre detección de ébola usan ese gen.
Ya por último, lo que a muchos os interesa. He buscado los precios de varios kits de ese estilo (algunos disponibles al público general), tanto el de la PCR como el de purificación de RNA, y hecho una estimación. Asumiendo que cualquier laboratorio tiene al menos un termociclador, incluso la mayoría pueden acceder a uno que mida la fluorescencia… El precio en reactivos por un test es de menos de 10 euros. Ahora, que alguien me explique por qué estamos midiendo la temperatura en lugar de hacer un test diario a todos los posibles infectados.
Espero haber servido de ayuda a aquellos que no estaban entendiendo nada. Los que entendéis disculpadme, pero esto no iba para vosotros. Dádselo a vuestros padres, a vuestros abuelos, al panadero de la esquina. Y por supuesto, como sé que no he entrado en detalle y que quedan muchas dudas, y que me he dejado mil cosas por el camino, preguntad lo que sea y puedo ir actualizando y mejorando los datos.
Por si alguien tiene la paciencia (a mi me ha llevado un rato) y quiere leerse todo el manual del kit: enlace al pdf publicado por la FDA.
