CSI ♕bicho y escenarios

[Despistado3 (versión3.0)]

Continuación (V).

22.04.2020

Escribe Yuri Deigin.

Lab-made? CoV2 genealogy through the lens of gain-of-function research
Lab-Made? SARS-CoV-2 Genealogy Through the Lens of Gain-of-Function Research

¿Hecho en laboratorio? Genealogía del SARS-CoV-2 a través de la lente de la investigación de ganancia de función

Spoiler

Para ser claros, muchos coronavirus tienen sitios furin de origen natural y son muy diversos. Evidentemente, pueden aparecer como resultado de mutaciones aleatorias. Esto es lo que sucedió en el caso del MERS, como señaló en 2015 un equipo internacional de autores, entre ellos Shi Zhengli y Ralph Baric, dos estrellas de la coronavirusología sintética (Two Mutations Were Critical for Bat-to-Human Transmission of Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus). Volveremos a ellos muchas veces, pero por ahora, algunas palabras sobre ese artículo. En él, los autores han demostrado que solo dos mutaciones permitieron que MERS saltara de murciélagos a humanos, y una de estas mutaciones creó un sitio furin. Aunque no fue una inserción de nuevos aminoácidos, sino una mutación de uno existente (marcado en rojo a la izquierda a continuación):

Los autores no solo mostraron esto, sino que en realidad volvieron a introducir estas mutaciones en la cepa de murciélago original: crearon el mismo sitio de furina y demostraron que permite que la cepa de murciélago infecte células humanas:

Para evaluar los posibles cambios genéticos necesarios para que HKU4 infecte células humanas, rediseñamos el pico de HKU4, con el objetivo de desarrollar su capacidad para mediar la entrada viral en células humanas. Con este fin, introdujimos dos mutaciones simples, S746R y N762A, en el pico de HKU4. Se esperaba que la mutación S746R restaurara el motivo hPPC en el pico HKU4, mientras que la mutación N762A probablemente interrumpió el sitio potencial de glicosilación ligado a N en el motivo hECP en el pico HKU4.​

​

...​

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Examinamos la capacidad del pico de HKU4 mutante para mediar la entrada viral en tres tipos de células humanas (Fig.3A para células HEK293T; datos no mostrados para células Huh-7 y MRC-5) (PubMed Central, FIG 3: J Virol. 2015 Sep 1; 89(17): 9119–9123. Published online 2015 Jun 10. doi: 10.1128/JVI.01279-15), usando un ensayo de entrada de pseudovirus como se describió anteriormente (14) (Two Mutations Were Critical for Bat-to-Human Transmission of Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus). En ausencia de proteasa tripsina exógena, los pseudovirus HKU4 que llevaban el motivo hPPC rediseñado o el motivo hECP rediseñado pudieron ingresar a las células humanas, mientras que los pseudovirus HKU4 que llevaban ambos motivos de proteasa humana rediseñados ingresaron a las células humanas tan eficientemente como cuando se activaron con tripsina exógena (Figura 3A) (PubMed Central, FIG 3: J Virol. 2015 Sep 1; 89(17): 9119–9123. Published online 2015 Jun 10. doi: 10.1128/JVI.01279-15). Por el contrario, los pseudovirus HKU4 de tipo salvaje no lograron entrar en las células humanas. Por lo tanto, los motivos de hPPC y hECP rediseñados permitieron que el pico de HKU4 fuera activado por proteasas endógenas humanas y de ese modo permitió que los pseudovirus de HKU4 evitaran la necesidad de que las proteasas exógenas ingresaran en las células humanas. Estos resultados revelan que el pico de HKU4 solo necesita dos mutaciones únicas en el límite S1/S2 para obtener la capacidad total de mediar la entrada viral en las células humanas.​

Por cierto, cómo lo hicieron podría asustar a aquellos que no están familiarizados con la biotecnología moderna, porque los autores insertaron esta proteína con forma de pico de coronavirus en el VIH inactivado:

Brevemente, se prepararon retrovirus pseudotipados con espigas de MERS-CoV que expresan un gen indicador de luciferasa cotransfectando células HEK293T con un plásmido que lleva el genoma del VIH-1 que expresa luciferasa y defectuoso en Env (pNL4-3.luc.RE-) y un plásmido que codifica Proteína de pico MERS-CoV.​

Quizás esto es lo que llevó a los investigadores indios a buscar secuencias similares al VIH en el genoma de CoV2 (Uncanny similarity of unique inserts in the 2019-nCoV spike protein to HIV-1 gp120 and Gag) (pero su preimpresión fue rápidamente criticada por su mala metodología y conclusiones erróneas). De hecho, los expertos usan estos pseudovirus con regularidad y, en general, no se debe temer a los retrovirus como clase; sus lentivirus de subespecies se han utilizado para terapia génica durante muchos años.

¿De dónde vino RaTG13?

RaTG13 es una cepa muy inusual. Es extraño ver que el grupo de Shi Zhengli guardó silencio al respecto durante todos estos años. Después de todo, es muy diferente de sus hermanos similares al SARS, especialmente en la proteína de pico, que es precisamente lo que determina qué tipos de células (y en qué animales) puede infectar este virus. Aquí hay un gráfico de similitud del genoma de CoV2 en comparación con otros coronavirus de murciélago (panel B):

La curva roja representa RaTG13 mientras que la curva azul es para las cepas más cercanas a RaTG13 (ZXC21 y ZC45). Estas cepas se aislaron (Genomic characterization and infectivity of a novel SARS-like coronavirus in Chinese bats) de murciélagos de herradura chinos (Rhinolophus sinicus) (Chinese rufous horseshoe bat - Wikipedia) en Zhoushan (https://ru.wikipedia.org/wiki/Чжоушань) en 2015 (ZXC21) (Bat SARS-like coronavirus isolate bat-SL-CoVZXC21, complete genome - Nucleotide - NCBI) y 2017 (ZC45) (Bat SARS-like coronavirus isolate bat-SL-CoVZC45, complete genome - Nucleotide - NCBI). Como puede verse en el gráfico anterior, incluso ellos difieren en sus proteínas S de RaTG13. Una comparación de secuencia directa ilustra mejor esta diferencia:

Como podemos ver, las proteínas de pico de ZXC21 y ZC45 no solo son 23-24 residuos de aminoácidos más cortas que la proteína RaTG13, sino que son más cortas en el lugar más importante: en la RBM (observe las deleciones en el cuadro rojo marcadas con guiones rojos).

Entonces, ¿de dónde vino RaTG13? Como ya mencioné, en 2020 Shi Zhengli informó que lo aisló en 2013 de murciélagos de herradura de Yunnan (de Rhinolophus affinis, no de los sospechosos habituales R. sinicus). Pero hasta enero de 2020, no se conocía la existencia de esta cepa, y así es como el grupo de Shi Zhengli describió su descubrimiento sobre la similitud de RaTG13 con CoV2 (A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin):

Luego, descubrimos que una región corta de ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp) de un coronavirus de murciélago (BatCoV RaTG13), que se detectó previamente en Rhinolophus affinis de la provincia de Yunnan, mostró una alta identidad de secuencia con 2019-CoV2. Llevamos a cabo una secuenciación completa en esta muestra de ARN (número de acceso de GISAID EPI_ISL_402131). El análisis de Simplot mostró que 2019-CoV2 era muy similar en todo el genoma a RaTG13 (Fig. 1c), con una identidad de secuencia genómica general del 96,2%.​

Poco detalle: detectado previamente, y eso es todo. Además, la cita parece implicar que hasta 2020, solo secuenciaron una parte de su genoma, el gen RdRp (que es parte de Orf1b que precede al gen de la proteína pico). Ok, pero ¿dónde se obtuvo exactamente en Yunnan? El periódico no lo menciona, ni GenBank tampoco. Sin embargo, la entrada de GISAID parece tener un poco más de información: recopilada en la ciudad de Pu'er de la muestra fecal de un murciélago macho:

Esto hizo sonar las campanas, ya que en mis vagabundeos por Pubmed, ya me había encontrado con una expedición a Pu'er en el verano de 2013:

Los murciélagos fueron capturados de varios lugares en cinco condados de cuatro prefecturas de la provincia de Yunnan, China, de mayo a julio de 2013.​

Los investigadores no informaron nada particularmente interesante para nosotros de esa expedición, pero tal vez fue entonces cuando Shi Zhengli o alguien de su grupo obtuvo la muestra RaTG13. La cual secuenciaron solo parcialmente, y por alguna razón decidieron no publicar, aunque era muy diferente a todo lo conocido antes.

Por cierto, Shi Zhengli bien podría haber participado personalmente en esa expedición, ya que expresó gran cariño al describirlos, por ejemplo, en su charla tipo TED en 2018, donde mostró fotos personales de tales expediciones:

LINK NO DISPONIBLE:

Además, fue una serie de expediciones exactamente lo que le dio a Shi Zhengli fama mundial y un apodo de "Batwoman" (How China’s ‘Bat Woman’ Hunted Down Viruses from SARS to the New Coronavirus): en un artículo de Nature de 2013 (https://www.nature.com/articles/nature12711), su grupo anunció triunfalmente que en las cuevas de Yunnan habían descubierto murciélagos portadores de las cepas RsSHC014 y Rs3367 que coincidían con el primer SARS-CoV en un 85% y un 96%, respectivamente.

Es una gran coincidencia que aproximadamente al mismo tiempo en Yunnan, el grupo de Shi Zhengli también descubriera RaTG13, la cepa más cercana a CoV2, y los dos también comparten el 96% de sus genomas.

 

[Despistado3 (versión3.0)]

Continuación (VI).

22.04.2020

Escribe Yuri Deigin.

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Spoiler

ACTUALZIACION: ¿RaTG13 es lo mismo que RaBtCoV / 4991?

[ACTUALIZADO] Después de haber publicado esta publicación (https://osf.io/wy89d/), me señalaron esta preimpresión que alega que RaTG13 es, de hecho, RaBtCoV/4991 (KP876546) (Rhinolophus bat coronavirus BtCoV/4991 RNA-dependent RNA polymerase (R - Nucleotide - NCBI), que Shi Zhengli había informado previamente haber descubierto en un pozo de mina abandonado en Yunnan en 2013 (Coexistence of multiple coronaviruses in several bat colonies in an abandoned mineshaft - PubMed). De hecho, hay varias razones para pensar que sí. En primer lugar, la única secuencia publicada para RaBtCoV/4991 es 100% idéntica a la de RaTG13 a nivel de nucleótidos, aunque es solo un tramo de 370 pb del gen RdRp:

En segundo lugar, los detalles de la recolección de las dos cepas son casi idénticos: ambas fueron recolectadas en julio de 2013 de un hisopo fecal de murciélagos R. affinis:

RaBtCoV/4991 se recogió en un pozo de extracción ubicado en el condado de Mojiang, que está bajo la jurisdicción de la ciudad de Pu'er:

Mojiang Hani Autonomous County is an autonomous county under the jurisdiction of Pu’er City, in the south of Yunnan Province, China (Mojiang Hani Autonomous County - Wikipedia).​

Y la ciudad de Pu'er figura como la ubicación de recolección de RaTG13 en la base de datos de GISAID, lo que bien podría ser una aproximación al pozo de la mina de Mojiang.

Es extraño que en su artículo de 2020 sobre RaTG13 (A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin), Shi Zhengli no mencione RaBtCoV/4991 ni cite su artículo de 2016 sobre su descubrimiento (Coexistence of multiple coronaviruses in several bat colonies in an abandoned mineshaft - PubMed), por lo que figura como la que “diseñó y coordinó el estudio”. No es que RaBtCoV/4991 haya sido olvidado por su grupo, como se menciona en su artículo de 2019 (Characterization of a New Member of Alphacoronavirus with Unique Genomic Features in Rhinolophus Bats), donde se incluye en un árbol filogenético de otros coronavirus:

Dudo que el lugar que ocupa RaBtCoV/4991 en ese árbol se haya determinado basándose únicamente en un fragmento de 370 pb, por lo que creo que a principios de 2019, el grupo de Shi Zhengli habría secuenciado su genoma completo.

Curiosamente, los genomas de pangolin-2017 y pangolin-2019 también están muy cerca en este tramo del gen RdRp, y CoV2 y pangolin-2019 comparten algunas mutaciones comunes que no se encuentran en RaTG13:

Pero dejemos este tema a un lado por ahora y volvamos a la historia del famoso artículo de Shi Zhengli publicado en Nature en 2013.

"Wuhan-1"

En ese artículo (https://www.nature.com/articles/nature12711), el grupo de Shi Zhengli también informó que al cultivar las muestras aisladas en células Vero de mono (https://ru.wikipedia.org/wiki/Vero), lograron aislar un virus vivo que era casi idéntico a la cepa Rs3367. Los autores nombraron su creación WIV1 (donde WIV significa Wuhan Institute of Virology):

Lo más importante es que informamos del primer aislamiento registrado de un SL-CoV vivo (SL-CoV-WIV1 de murciélago) a partir de muestras fecales de murciélago en células Vero E6, que tiene una morfología típica de coronavirus, una identidad de secuencia del 99,9% con Rs3367 y utiliza ACE2 de humanos, civetas y murciélagos de herradura chinos para la entrada de la celda. Las pruebas preliminares in vitro indican que WIV1 también tiene un amplio tropismo de especies.​

Comparemos RaTG13 con Rs3367 y RsSHC014:

 

[Despistado3 (versión3.0)]

Continuación (VII).

22.04.2020

Escribe Yuri Deigin.

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Como podemos ver, las proteínas de punta de estas cepas no solo son 13 aminoácidos más cortas que las de RaTG13, sino que también difieren sustancialmente en el primer cuarto de la proteína. Por cierto, es curioso que las proteínas de pico de Rs3367 (también conocido como WIV1) y RsSCH014 sean casi idénticas y difieran solo en la región RBD (secuencia derecha abajo). Casi como CoV2 y RaTG13 (sin contar el inserto de furin):

¿Podrían los investigadores, después de haber recibido muestras de coronavirus de pangolines que fueron interceptados por la aduana en marzo de 2019, querer verificar si el RBM en las cepas de pangolín puede unirse al receptor ACE2 humano? ¿Y podrían estos investigadores también decidir agregar un sitio de furin adicional a la mezcla?

Teóricamente, por supuesto, podrían. Desde un punto de vista técnico, es casi rutinario que los virólogos lleven a cabo tales experimentos. Una pregunta razonable podría ser: ¿por qué utilizar RaTG13 como columna vertebral y no, digamos, el probado y verdadero WIV1? Bueno, no tiene por qué ser una u otra: tal vez también se probó una quimera con WIV1. Pero en paralelo, podrían haber decidido simular la recombinación del virus del pangolín con la cepa de murciélago más cercana; después de todo, RaTG13 está mucho más cerca de las cepas de pangolín que WIV1: su proteína de pico está más cerca de ellas tanto filogenética como estructuralmente. incluso los iguala en longitud, mientras que las proteínas de WIV1/Rs3367 y RsSHC014 son 13 aminoácidos más cortas. Además, la mutación QTQTNS común a RaTG13 y pangolin-2019 (MP789) justo antes del sitio de la proteasa no podría haber pasado desapercibida para los expertos en coronavirus.

Otras cepas de Yunnan

En 2011, otros investigadores también encontraron muestras de coronavirus de Yunnan Rhinolophus affinis (Identification of diverse alphacoronaviruses and genomic characterization of a novel severe acute respiratory syndrome-like coronavirus from bats in China - PubMed). La cepa LYRa11 me pareció la más interesante:

Pero también está bastante lejos de RaTG13, y mucho más cerca de Rs3367 (esa es la cepa que comparte el 96% con el primer SARS-CoV):

Pero RaTG13, aislado de los mismos murciélagos Rhinolophus affinis que LYRa11, se parece menos a él (comparación de secuencia izquierda).

Finalmente, otra cepa de Yunnan (ingenuamente llamada Yunnan2011), aislada en 2011 de otra subespecie de murciélagos de herradura, Rhinolophus pusillus, es incluso menos similar a RaTG13 que a LYRa11 (Novel SARS-like Betacoronaviruses in Bats, China, 2011):

Entre ellos, Yunnan2011 y LYRa11 (la secuencia de la derecha arriba) no son particularmente similares, aparte de la región S2 altamente conservada. Por cierto, ¿qué pasa con las diferentes convenciones de nomenclatura para estas cepas? A veces explican completamente el año, a veces parcialmente, pero en otras ocasiones no explican nada (Rs3367). La especie portadora a veces lidera (RaTG13), a veces sigue (LYRa11). ¿Y qué significan TG, LY o SHC? ¿Iniciales de la persona que secuencia el genoma?

De todos modos, pasemos de la arqueología viral a la ingeniería viral, es decir, trasplantar áreas clave de la proteína de pico entre especies y otros experimentos de ganancia de función (GOF).

1999: Primer coronavirus quimérico

Si cree que toda la investigación del coronavirus de ganancia de función sobre qué es exactamente lo que permite que los coronavirus salten de una especie a otra comenzó en respuesta al primer brote de SARS en 2002, estaría equivocado. Los virólogos experimentaron con coronavirus quiméricos mucho antes de eso. Aquí, por ejemplo, hay un artículo de 1999 del grupo holandés de Peter Rottier de la Universidad de Utrecht con un título revelador: Retargeting of Coronavirus by Substitution of the Spike Glycoprotein Ectodomain: Crossing the Host Cell Species Barrier (Reorientación de coronavirus por sustitución del ectodominio de glicoproteína de pico: cruzando la barrera de especies de células huésped) (Retargeting of Coronavirus by Substitution of the Spike Glycoprotein Ectodomain: Crossing the Host Cell Species Barrier):

Utilizando la recombinación de ARN dirigida, construimos un mutante del virus de la hepatitis de ratón coronavirus (MHV) en el que el ectodominio de la glicoproteína (S) de pico se reemplazó con el ectodominio altamente divergente de la proteína S del virus de la peritonitis infecciosa felina. El virus quimérico resultante, denominado fMHV, adquirió la capacidad de infectar células felinas y simultáneamente perdió la capacidad de infectar células murinas en cultivo de tejidos.​

Por cierto, Shi Zhengli parece haber trabajado durante un tiempo bajo la supervisión de Peter Rottier en Utrecht. Al menos en 2005, fue coautora de un documento conjunto en el que Utrecht figuraba como su afiliación (pero su dirección actual figuraba en el Shanghai Institute) (Murine Coronavirus with an Extended Host Range Uses Heparan Sulfate as an Entry Receptor). Ese artículo en sí es bastante curioso: en él, los autores investigaron qué es exactamente lo que permite que los virus expandan el tropismo de su especie:

Solo unas pocas mutaciones en su proteína de punta permiten que el coronavirus murino cambie de un tropismo restringido a murino a un rango de hospedadores extendido al pasar in vitro. Uno de esos virus que estudiamos había adquirido dos supuestos sitios de unión a sulfato de heparán mientras conservaba otro sitio en el motivo de escisión de furina. La adaptación del virus mediante el uso de heparán sulfato como receptor de unión/entrada se demostró por el aumento de la unión de heparina, así como por la inhibición de la infección mediante el tratamiento de las células y el virus con heparinasa y heparina, respectivamente.​

Es interesante que el sitio furin en ese virus (SRRAHR | SV) es similar al sitio en CoV2 (SPRRAR | SV), aunque en CoV2 se corta de manera más eficiente debido a las argininas duales (esto es lo que lo convierte en un sitio polibásico, es decir, tiene varios aminoácidos básicos seguidos en la secuencia RxxR):

Pero lo que es especialmente curioso es que las mutaciones que permitieron al virus "expandir sus horizontes" no ocurrieron en animales, sino in vitro. Además, parece que sucedieron bastante rápido:

MHV/pi23, un virus obtenido después de 23 de los 600 pases que dieron como resultado MHV/BHK, también contiene un sitio de unión de HS putativo en el dominio S1 en la misma posición que en MHV/BHK, aunque como una inserción más pequeña, mientras que carece del supuesto sitio de unión a HS inmediatamente aguas arriba del péptido de fusión. El MHV/pi23 infecta las células que no son de orina hasta cierto punto, pero de manera mucho menos eficiente que el MHV/BHK. Sin embargo, además de los múltiples sitios de unión a HS, las mutaciones encontradas en otras partes de la proteína S, como el dominio HR1 y el péptido de fusión putativo (Fig. 1), también podrían contribuir a la entrada eficiente en células que no son de orina. Actualmente estamos en el proceso de determinar las mutaciones de la proteína S que se requieren para el fenotipo de rango extendido de hospedadores.​

 

[Despistado3 (versión3.0)]

Continuación (VIII).

22.04.2020

Escribe Yuri Deigin.

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Saltando adelante, solo mencionaré que hubo otros grupos que usaron mutagénesis in vitro para aumentar la virulencia de los coronavirus, por ejemplo, MERS (Adaptive Evolution of MERS-CoV to Species Variation in DPP4):

Para comprender mejor la adaptabilidad de especies de MERS-CoV, identificamos una variante subóptima derivada de especies de DPP4 para estudiar la adaptación viral. El paso del virus por las células que expresan esta variante de DPP4 condujo a la acumulación de mutaciones en el pico viral que aumentó la replicación.​

Además, sus mutaciones surgieron después de varios pases (rondas de reproducción de cultivos celulares):

Pero esos experimentos ocurrieron mucho más tarde. Mientras tanto, volvamos a 2002, ANTES del brote del primer SARS-CoV.

Ralph "Trailblazer" Baric

Ralph Baric es una leyenda en coronavirología. Es un pionero de las técnicas sintéticas de manipulación genómica. En 2002, publicó un trabajo revolucionario, que marcó un hito tanto en el estudio de varios mecanismos de los virus naturales como en la investigación de la ganancia de función (Systematic Assembly of a Full-Length Infectious cDNA of Mouse Hepatitis Virus Strain A59). En su artículo, el grupo Baric describió la creación de un clon sintético de un coronavirus murino natural:

Se desarrolló un método novedoso para ensamblar un ADNc infeccioso de longitud completa de la cepa A59 del virus de la hepatitis de ratón del coronavirus del grupo II (MHV-A59). Se aislaron siete clones de ADNc contiguos que abarcaban el genoma del MHV de 31,5 kb. Los extremos de los ADNc se diseñaron con uniones únicas y se ensamblaron solo con los subclones de ADNc adyacentes, lo que dio como resultado una construcción de ADNc de MHV-A59 intacta de aproximadamente 31,5 kb de longitud. Las uniones de los sitios de restricción de interconexión que se encuentran en los extremos de cada ADNc se eliminan sistemáticamente durante el ensamblaje del producto completo de ADNc de longitud completa, lo que permite el reensamblaje sin la introducción de cambios de nucleótidos ... El método tiene el potencial de usarse para construir virus, genomas microbianos o eucariotas que se acercan a varios millones de pares de bases de longitud y se utilizan para insertar sitios de restricción en cualquier nucleótido dado en un genoma microbiano.​

En esencia, los autores han "traducido" el virus de ARN al lenguaje del ADN (utilizando transcriptasa inversa), lo que les permitió manipular su genoma con la ayuda de herramientas de ingeniería genética existentes. Después de crear 7 segmentos de provirus de ADNc de este tipo, los autores los unieron "sin problemas" (es decir, sin introducir mutaciones nuevas, incluso silenciosas, incluidos nuevos sitios de restricción), después de lo cual transcribieron su construcción de nuevo en ARN, que luego se tradujo en virus partículas en otras células.

SARS-2003

Apenas unas semanas después de la publicación del trabajo anterior, estalló la primera epidemia de SARS-CoV (2002–2004 SARS outbreak - Wikipedia). El grupo Baric entró en acción. Para el verano de 2003, presentaron un documento sobre la recreación sintética del SARS-CoV (Reverse genetics with a full-length infectious cDNA of severe acute respiratory syndrome coronavirus):

Utilizando un panel de ADNc contiguos que abarcan todo el genoma, hemos reunido un ADNc de longitud completa de la cepa Urbani de SARS-CoV y rescatado virus del SARS clonados molecularmente (clon infeccioso SARS-CoV) que contenían las mutaciones de marcador esperadas insertadas en los clones del componente. Los virus recombinantes se replicaron tan eficientemente como el virus WT y ambos fueron inhibidos por el tratamiento con el inhibidor de la cisteína proteinasa ... La disponibilidad de un ADNc de longitud completa del SARS-CoV proporciona una plantilla para la manipulación del genoma viral, lo que permite el desarrollo rápido y racional y las pruebas de vacunas candidatas y terapias contra este importante patógeno humano.​

La velocidad del grupo de Baric ilustra lo rápido que un equipo calificado de virólogos puede crear un clon sintético a partir de un virus natural y, por lo tanto, hacerle modificaciones genéticas. Además, eso fue en 2003. Hoy, un laboratorio calificado puede repetir esos pasos en cuestión de semanas.

De hecho, dos acaban de hacerlo: los suizos han creado un clon sintético de CoV2 en menos de un mes (Rapid reconstruction of SARS-CoV-2 using a synthetic genomics platform), mientras que el laboratorio de Galveston BSL4 tardó menos de 2 meses en hacerlo (An Infectious cDNA Clone of SARS-CoV-2).

SARS-2006

Baric fue el primero, pero lejos del último. Ingeniería genética desarrollada a pasos agigantados, creando nuevas y mejores herramientas. Otros grupos exploraron técnicas alternativas de virología sintética. Por ejemplo, en 2006, investigadores españoles siguieron los pasos de Baric, creando también un clon sintético del SARS, pero utilizando un enfoque alternativo (cromosoma artificial bacteriano) (Construction of a Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Infectious cDNA Clone and a Replicon To Study Coronavirus RNA Synthesis):

En este estudio se describe la ingeniería de un clon de ADNc infeccioso de longitud completa y un replicón funcional de la cepa Urbani del coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV) como cromosomas artificiales bacterianos (BAC). En este sistema, el ARN viral se expresó en el núcleo celular bajo el control del promotor del citomegalovirus y se amplificó adicionalmente en el citoplasma por la replicasa viral. Tanto el clon infeccioso como el replicón fueron completamente estables en Escherichia coli.​

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El clon de ADNc infeccioso de SARS-CoV ensamblado fue completamente estable durante su propagación en células de E. coli DH10B durante más de 200 generaciones, lo que facilitó considerablemente la manipulación genética del genoma viral (datos no mostrados). La estrategia de clonación detallada, los mapas de plásmidos y las secuencias están disponibles a pedido.​

Estrategia para ensamblar un clon de ADNc infeccioso del SARS-CoV como un BAC. (A) Estructura genética del genoma de la cepa SARS-CoV Urbani. Se indican los sitios de restricción relevantes usados para el ensamblaje del clon de ADNc de longitud completa. Los números entre paréntesis indican las posiciones genómicas del primer nucleótido de la secuencia de reconocimiento de la endonucleasa de restricción. Las letras y los números indican los genes virales. L, secuencia líder; UTR, región no traducida; Una cola de poli (A). (B) Construcción de pBAC-SARS-CoV 5′-3′. Después de la selección de los sitios de restricción apropiados, se construyó el plásmido intermedio pBAC-SARS-CoV 5'-3' como el esqueleto para ensamblar el clon de ADNc infeccioso. Este plásmido incluye los primeros 681 nt del genoma bajo el control del promotor CMV, un sitio de clonación múltiple que contiene los sitios de restricción seleccionados para el ensamblaje final del clon infeccioso, y los últimos 975 nt del genoma, seguido de un cola de poli (A) (pA), la ribozima del virus de la hepatitis delta (Rz) y las secuencias de poliadenilación y terminación de la hormona del crecimiento bovino (BGH). Todos estos elementos se unieron con precisión mediante PCR superpuesta. Se muestran el inicio de la transcripción del promotor de CMV y el sitio de escisión de la ribozima. © Diagrama esquemático que muestra la estrategia de clonación de cinco pasos utilizada para el ensamblaje del clon de ADNc de longitud completa del SARS-CoV. Los cinco fragmentos de ADNc superpuestos, denominados SARS 1 a SARS 5, se clonaron secuencialmente en el plásmido pBAC-SARS-CoV 5'-3' para generar el plásmido pBAC-SARS-CoVFL. Se indican los sitios de restricción relevantes. Las etiquetas son las descritas para el panel A. Más información sobre este texto de origen. Para obtener más información sobre la traducción, se necesita el texto de origen.

Es cierto que no lo hicieron tan elegantemente como Baric, ya que su ensamblaje final del virus sintético incluyó sus sitios de enzimas de restricción agregados, mientras que Baric aprendió a combinar fragmentos "sin problemas". Pero este es un punto menor, el enfoque español es igual de sólido: en 2013, con su ayuda, los mismos autores habían creado un clon sintético de MERS (Engineering a Replication-Competent, Propagation-Defective Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus as a Vaccine Candidate), y en 2015 su técnica se incluyó en un libro de texto sobre coronavirus (capítulo 13) (Coronaviruses | SpringerLink).

Wuhan 2007

Regresemos a 2007. Fue entonces cuando el grupo Shi Zhengli se unió a la carrera de virología sintética con un estudio de la proteína de pico de los coronavirus humanos y murciélagos (Coronaviruses | SpringerLink), tratando de determinar qué es exactamente responsable de la capacidad de saltar de una especie a otra:

Se construyeron una serie de quimeras S insertando diferentes secuencias del SARS-CoV S en la columna vertebral de SL-CoV S.​

Es decir, los autores insertaron diferentes segmentos de la proteína de pico del SARS-CoV humano en la proteína de pico del virus del murciélago. Aquí está su conclusión:

A partir de estos resultados, se dedujo que la región de aa 310 a 518 de BJ01-S era necesaria y suficiente para convertir Rp3-S en una molécula de unión a huACE2.​

Al mismo tiempo, intentaron reemplazar fragmentos más cortos, incluido solo el RBM:

Para la introducción de la RBM de SARS-CoV S en SL-CoV S, se usó la región codificante de aa 424 a 494 de BJ01-S para reemplazar las regiones correspondientes de Rp3-S, dando como resultado un gen S (CS) quimérico designado CS424–494.​

Dado que lo anterior se escribió en 2007, creo que hoy no será difícil, ni siquiera para un virólogo novato, reemplazar la RBM de un virus por la RBM de otro.

Quimera-2015

A la luz de los experimentos anteriores, no está muy claro qué causó el alboroto que siguió, probablemente, al artículo de virología de ganancia de función más famoso. Me refiero al trabajo conjunto de 2015 de Shi Zhengli y Ralph Baric, en el que crearon un virus quimérico sintético (https://www.nature.com/articles/nm.3985):

Utilizando el sistema de genética inversa del SARS-CoV, generamos y caracterizamos un virus quimérico que expresa el pico del coronavirus de murciélago SHC014 en una columna vertebral del SARS-CoV adaptada al ratón. Los resultados indican que los virus del grupo 2b que codifican el pico SHC014 en una columna vertebral de tipo salvaje pueden usar de manera eficiente múltiples ortólogos de la enzima convertidora de angiotensina humana II (ACE2) del receptor del SARS, replicarse de manera eficiente en las células primarias de las vías respiratorias humanas y lograr títulos in vitro equivalentes epidémicos a cepas de SARS-CoV. Además, los experimentos in vivo demuestran la replicación del virus quimérico en el pulmón del ratón con una patogénesis notable. La evaluación de las modalidades inmunoterapéuticas y profilácticas disponibles basadas en el SRAS reveló una eficacia deficiente; tanto los enfoques de anticuerpos monoclonales como de vacunas no lograron neutralizar ni proteger de la infección con CoV utilizando la nueva proteína de pico. Sobre la base de estos hallazgos, volvimos a derivar sintéticamente un virus recombinante SHC014 infeccioso de longitud completa y demostramos una replicación viral robusta tanto in vitro como in vivo.​

Para mí, los autores siguieron un camino familiar: tomaron la proteína en forma de espiga de RsSHC014, que Shi Zhengli aisló de los murciélagos de Yunnan en 2011, y la insertaron en una variante del SARS-CoV adaptada al murino para experimentos posteriores in vivo. También lo probaron en células humanas, y casi como un aparte crearon un clon recombinante de la misma cepa RsSHC014:

a) Esquema del clon molecular SHC014-CoV, que se sintetizó como seis ADNc contiguos (designados SHC014A, SHC014B, SHC014C, SHC014D, SHC014E y SHC014F) flanqueado por sitios BglI únicos que permitieron el ensamblaje dirigido del ADNc de longitud completa que expresa marcos de lectura abiertos (para 1a, 1b, pico, 3, envoltura, matriz, 6–8 y nucleocápside). Los nucleótidos subrayados representan las secuencias salientes formadas después de la escisión con enzimas de restricción.

 

[Despistado3 (versión3.0)]

Continuación (IX).

22.04.2020

Escribe Yuri Deigin.

Lab-made? CoV2 genealogy through the lens of gain-of-function research
Lab-Made? SARS-CoV-2 Genealogy Through the Lens of Gain-of-Function Research

¿Hecho en laboratorio? Genealogía del SARS-CoV-2 a través de la lente de la investigación de ganancia de función

Spoiler

Los investigadores también descubrieron que no era solo la unión de la proteína de pico al receptor lo que determinaba el potencial del virus para la transición de una especie animal a otra, porque la quimera SHC014-MA15 era más virulenta que la propia SHC014, incluso en células humanas:

En particular, el tropismo diferencial en el pulmón en comparación con el SARS-MA15 y la atenuación de SHC014-CoV de longitud completa en cultivos de [células de las vías respiratorias epiteliales humanas] en relación con el SARS-CoV Urbani sugieren que los factores más allá de la unión de ACE2, incluida la biodisponibilidad o antagonismo de las respuestas inmunitarias del huésped - puede contribuir a la emergencia.​

En especial, quiero resaltar la procesividad del pico en la cita, porque esta no es la primera vez que los virólogos mencionan que la capacidad de una proteína de pico para ser escindida por proteasas (incluida la furina) puede tener un impacto en la virulencia.

Eso es todo lo que tengo que decir sobre ese documento. Como curiosidad, aquí hay una foto común de sus autores clave, que fue tomada en Wuhan, en octubre de 2018. Oportunamente, Ralph Bariс y Shi Zhengli están al frente y en el centro. Llamo a esta foto "El Clan Wuhan". (Lo siento, no pude resistir).

SARS murino-2007

Un aparte rápido sobre el "virus murino MA15" del artículo anterior. No se trataba de una especie de coronavirus murino natural, como podría pensarse. Era un SARS-CoV humano modificado en laboratorio, que en 2007 el grupo Baric, posiblemente en competencia con el grupo Shi Zhengli (recuerde su artículo de 2007), se convirtió en una verdadera bestia (A Mouse-Adapted SARS-Coronavirus Causes Disease and Mortality in BALB/c Mice). Para hacer esto, primero lo "mejoraron" iterativamente en ratones, y cuando después de varias iteraciones se volvió "efectivo" al máximo, reprodujeron las mutaciones observadas en un clon sintético, y una vez más comprobaron que realmente tiene mayor virulencia y letalidad:

Adaptamos el SARS-CoV (cepa Urbani) mediante pases seriados en el tracto respiratorio de ratones BALB/c jóvenes. Quince pases dieron como resultado un virus (MA15) que es letal para los ratones tras la inoculación intranasal. La letalidad está precedida por una replicación viral rápida y de títulos altos en los pulmones, viremia y diseminación del virus a sitios extrapulmonares acompañada de linfopenia, neutrofilia y cambios patológicos en los pulmones. El antígeno viral abundante se distribuye extensamente en las células epiteliales bronquiales y los neumocitos alveolares, y hay restos celulares necróticos en las vías respiratorias y los alvéolos, con neumonitis leve y focal solamente. Estas observaciones sugieren que los ratones infectados con MA15 mueren a causa de una infección viral abrumadora con destrucción extensa, mediada por virus, de neumocitos y células epiteliales ciliadas. El virus MA15 tiene seis mutaciones codificantes asociadas con la adaptación y una mayor virulencia; cuando se introducen en un SARS-CoV recombinante, estas mutaciones dan como resultado un virus altamente virulento y letal (rMA15), que duplica el fenotipo del virus MA15 de origen biológico. La inoculación intranasal con MA15 reproduce muchos aspectos de la enfermedad observada en casos humanos graves de SARS.​

Baric-2008

Aquí hay otro ejemplo de la potencial rivalidad científica entre los grupos Baric y Shi Zhengli. En 2008, el grupo Baric tomó la cepa Bat-SCoV y reemplazó su RBD con un RBD de SARS humano (Synthetic recombinant bat SARS-like coronavirus is infectious in cultured cells and in mice). Es decir, esencialmente reprodujeron el trabajo del grupo de Shi Zhengli de 2007, excepto que no se limitaron a pseudovirus, sino que crearon un virus quimérico real:

Aquí, informamos el diseño, la síntesis y la recuperación de la forma de vida de replicación sintética más grande, un coronavirus similar al síndrome respiratorio agudo severo (SARS) de murciélago de 29,7 kb (Bat-SCoV), un probable progenitor de la epidemia de SARS-CoV.​

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Para probar si los RBD de Bat-SCoV y SARS-CoV eran intercambiables, reemplazamos el RBD de Bat-SCoV (aminoácido 323-505) con el RBD de SARS-CoV (aminoácido 319-518) (27, 28) (GenBank número de acceso FJ211860), simulando un evento de recombinación teórico que podría ocurrir durante la infección mixta in vivo (Fig. 1B).​

(B) Representación esquemática que muestra la organización de las proteínas de pico de SARS-CoV y Bat-SCoV. Las proteínas de Spike diseñadas se muestran a continuación con el nombre del virus a la izquierda. Bat-SRBD incluye toda la secuencia Bat-SCoV Spike excepto que el Bat-SCoV RBD (aminoácido Bat-SCoV 323–505) se reemplaza con el SARS-CoV RBD (aminoácido 319–518) (número de acceso de GenBank FJ211860 ). Bat-SRBD-MA incluye el cambio MA15 Spike RBD en SARS-CoV aa Y436H. Bat-SRBM incluye los 13 residuos mínimos de SARS-CoV críticos para el contacto con ACE2, lo que da como resultado un RBD quimérico del aminoácido 323I-429T de Bat-SCoV y el aminoácido 426R-518D del SARS-CoV. Bat-Hinge es la secuencia Bat-SRBM, con el aminoácido 392L-397E de Bat-SCoV reemplazado por el aminoácido 388V-393D del SARS-CoV. Bat-F incluye nt 1–24057 de SARS-CoV (al aminoácido 855 de Spike), con la secuencia 3 'restante de Bat-SCoV. A la derecha de las representaciones esquemáticas, se indican la observación de la actividad de la transcripción y los títulos de stock aproximados en el paso 1 (P1). ND indica que no se han detectado virus infecciosos mediante el ensayo de placa.

Baric-2016

El grupo Baric parece tener su parte de artículos similares. Por ejemplo, en 2016, esencialmente repitieron su colaboración con Shi Zhengli de 2015 para crear un virus quimérico (SARS-like WIV1-CoV poised for human emergence), solo que esta vez insertaron un segmento de proteína de pico en su SARS adaptado al ratón, no de RsSCH014, sino de otra cepa de Shi Zhengli encontrada en Yunnan, su pariente cercano Rs3367. O, para ser exactos, de WIV1, el clon de laboratorio de Rs3367 aislado en el Wuhan Institute of Virology en 2013:

Utilizando el clon infeccioso de SARS-CoV como plantilla (7), diseñamos y sintetizamos un clon infeccioso de longitud completa de WIV1-CoV que consta de seis plásmidos que podrían cortarse enzimáticamente, ligarse y electroporarse en las células para rescatar una progenie competente para la replicación viriones (Fig. S1A). Además del clon de longitud completa, también producimos el virus quimérico WIV1-CoV que reemplazó el pico de SARS con el pico de WIV1 dentro del esqueleto adaptado al ratón (WIV1-MA15, Fig. S1B). … Para confirmar la cinética de crecimiento y la replicación, se infectaron células Vero con SARS-CoV Urbani, WIV1-MA15 y WIV1-CoV.​

Para mí, el artículo de 2016 se parece mucho al de 2015. Además, su razón fundamental no me queda muy clara: después de todo, WIV1/Rs3367 ya compartía el 96% de su genoma con el SARS-CoV. Así que no estoy seguro de por qué querríamos insertar una proteína de pico de su pariente más cercano en el SARS-CoV. Quizás solo porque podían. En este sentido, el título del artículo adquiere una cierta dualidad: WIV1-CoV similar al SARS preparado para la emergencia humana.

Ah, y no estoy seguro de cómo en 2015 se le otorgó a Baric una patente para la creación de "proteínas de pico de coronavirus quiméricas" (WO2015143335A1 - Methods and compositions for chimeric coronavirus spike proteins - Google Patents), dado todo lo que él y Shi Zhengli revelaron previamente en sus artículos mucho antes de 2015.

Baric-1990

Para que aprecie cuánto tiempo ha estado Ralph Baric en este juego: estaba diseñando coronavirus recombinantes mucho antes de que existieran máquinas de secuenciación de ADN u otras herramientas modernas de ingeniería genética. Aquí está su artículo sobre la creación de "mutantes de temperatura" a partir del coronavirus del ratón de 1990 (https://link.springer.com/content/pdf/10.1007/978-1-4684-5823-7_47.pdf):

La cepa A59 del virus de la hepatitis de ratón (MHV-A59) se utilizó durante el transcurso de este estudio. El virus se propagó y clonó tres veces en la línea celular continua de astrocitoma murino (DBT).​

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Se mezclaron e inocularon varias combinaciones de mutantes [sensibles a la temperatura] en células con una multiplicidad de infección de 10 cada una.​

Entonces, el Dr. Baric ha estado creando virus mutantes durante más de 30 años.

Wuhan-2017

El grupo Shi Zhengli tampoco ha estado inactivo desde la famosa publicación de 2015. En 2017, publicaron un artículo en el que informaron que crearon no uno, sino 8 virus quiméricos, todos elaborados con RBD trasplantados de virus similares al SARS de murciélagos que recolectaron durante un lapso de 5 años en la misma cueva alrededor de Kunming, provincia de Yunnan, donde Shi Zhengli encontró originalmente Rs3367 y RsSCH014 (Discovery of a rich gene pool of bat SARS-related coronaviruses provides new insights into the origin of SARS coronavirus).

Utilizando la técnica de genética inversa que desarrollamos previamente para WIV1 [23], construimos un grupo de clones de cromosomas artificiales bacterianos infecciosos (BAC) con la columna vertebral de WIV1 y variantes de genes S de 8 diferentes murciélagos SARSr-CoV. Solo los clones infecciosos para Rs4231 y Rs7327 condujeron a efectos citopáticos en células Vero E6 después de la transfección (Fig. S7). Las otras seis cepas con deleciones en la región RBD, Rf4075, Rs4081, Rs4085, Rs4235, As6526 y Rp3 (Fig. S1) no pudieron ser rescatadas, ya que no se observaron efectos citopáticos y la replicación viral no se puede detectar mediante el ensayo de inmunofluorescencia en células Vero E6. (S7 Fig.). Por el contrario, cuando las células Vero E6 se infectaron respectivamente con los dos SARSr-CoV quiméricos rescatados con éxito, WIV1-Rs4231S y WIV1-Rs7327S, y el Rs4874 recién aislado, se detectó una replicación eficaz del virus en todas las infecciones (Figura 7).​

Gráfico de similitud basado en la secuencia del genoma de longitud completa de civet SARS CoV SZ3. Se utilizaron como secuencias de referencia secuencias genómicas completas de todos los SARSr-CoV detectados en murciélagos de la cueva investigada en este estudio. El análisis se realizó con el modelo de Kimura, un tamaño de ventana de 1500 pares de bases y un tamaño de paso de 150 pares de bases.

Luego, los autores verificaron si sus quimeras podían infectar células humanas, y esta vez usaron un virus sintético vivo, en lugar de construcciones de VIH no pseudo-tipadas como antes:

Para evaluar si los tres nuevos SARSr-CoV pueden usar ACE2 humano como receptor de entrada celular, realizamos estudios de infectividad del virus utilizando células HeLa con o sin la expresión de ACE2 humano. Todos los virus se replicaron eficazmente en las células humanas que expresan ACE2. Los resultados se confirmaron además mediante la cuantificación del ARN viral utilizando RT-PCR en tiempo real (Fig. 8).​

Baric-2019

Ralph Baric tampoco mostró signos de desaceleración. A finales de octubre de 2019, su grupo presentó para su publicación otro artículo sobre la importancia de la escisión de la proteasa de pico (¿recuerda el sitio de furina?) para cruzar la "barrera a la infección zoonótica" por coronavirus (Trypsin Treatment Unlocks Barrier for Zoonotic Bat Coronavirus Infection):

Juntos, estos resultados demuestran que la escisión por proteasa es también la principal barrera para la infección de células Vero con HKU5-CoV. Examinando más a fondo, comparamos la escisión predicha en el borde S1 / S2, S2', y el sitio de la cisteína proteasa endosómica en los picos de MERS, PDF2180 y HKU5 (Fig. 6D) (26). Para el sitio S1/S2, MERS, Uganda y HKU5 mantienen el motivo de escisión RXXR, aunque los diferentes aminoácidos interiores pueden alterar la eficacia. Para la secuencia S2’, MERS y HKU5 también retienen el motivo RXXR; sin embargo, el pico de Uganda carece de la primera arginina (SNAR), lo que podría afectar a la escisión.​

Cuando recuerdo el espíritu de competencia científica entre los grupos de Baric y Shi Zhengli, no puedo evitar preguntarme si alguien estaba realizando una investigación similar en el laboratorio de Wuhan en 2019.

 

[Despistado3 (versión3.0)]

Continuación (X).

22.04.2020

Escribe Yuri Deigin.

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Lab-Made? SARS-CoV-2 Genealogy Through the Lens of Gain-of-Function Research

¿Hecho en laboratorio? Genealogía del SARS-CoV-2 a través de la lente de la investigación de ganancia de función

Spoiler

Ganancia de función: negocio arriesgado

Muchas personas que se enteran por primera vez de la investigación anterior hacen una pregunta muy válida: "¿Pero por qué?" ¿Por qué los científicos crean virus asesinos quiméricos? La respuesta políticamente correcta es desarrollar medidas preventivas (medicamentos o vacunas) a partir de posibles quimeras naturales y comprender los riesgos de su aparición. De hecho, esto es lo que Baric, Shi Zhengli y los propios coautores escribieron sobre este tema en su famoso artículo de 2015:

Además de ofrecer preparación contra futuros virus emergentes, este enfoque debe considerarse en el contexto de la pausa en los estudios de ganancia de función (GOF) exigida por el gobierno de EEUU sobre la base de modelos de emergencia anteriores (Fig. 4a, b), no se esperaba que la creación de virus quiméricos como SHC014-MA15 aumentara la patogenicidad. Aunque SHC014-MA15 está atenuado en relación con su SARS-CoV adaptado al ratón parental, estudios similares que examinaron la patogenicidad de los CoV con el pico Urbani de tipo salvaje dentro de la columna vertebral MA15 no mostraron pérdida de peso en ratones y una replicación viral reducida. Por lo tanto, en relación con el pico Urbani-MA15 CoV, SHC014-MA15 muestra una ganancia en la patogénesis (Fig. 1). Sobre la base de estos hallazgos, los paneles de revisión científica pueden considerar que estudios similares que construyen virus quiméricos basados en cepas circulantes son demasiado riesgosos de realizar, ya que no se puede excluir una mayor patogenicidad en modelos de mamíferos. Junto con las restricciones sobre cepas adaptadas a ratones y el desarrollo de anticuerpos monoclonales utilizando mutantes de escape, la investigación sobre la aparición de CoV y la eficacia terapéutica puede verse seriamente limitada en el futuro. Juntos, estos datos y restricciones representan una encrucijada de preocupaciones de investigación del GOF; El potencial para prepararse y mitigar futuros brotes debe sopesarse con el riesgo de crear patógenos más peligrosos. Al desarrollar políticas en el futuro, es importante considerar el valor de los datos generados por estos estudios y si estos tipos de estudios de virus quiméricos justifican una mayor investigación frente a los riesgos inherentes involucrados.​

¿Fueron estas palabras proféticas? A fines de 2014, Estados Unidos introdujo una moratoria sobre el financiamiento estatal de tales estudios de ganancia de función (Moratorium on risky virology studies leaves work at 14 institutions in limbo), pero fue cancelada en breve (en 2017) (US government lifts ban on risky pathogen research). En China, no se introdujo ninguna moratoria sobre este tipo de estudios, por el contrario, siguieron adelante con la creación de nuevos "super laboratorios" del más alto nivel de bioseguridad (BSL-4), como en 2017 en Wuhan:

Para ser claros, al laboratorio de Wuhan se le permitió trabajar con coronavirus incluso antes de 2017, ya que estos virus solo requerían una calificación BSL-3 que tenía el Wuhan Institute of Virology. Pero sus aspiraciones de obtener BSL-4 inquietaron a mucha gente, incluidos colegas investigadores (Nature News & Comment):

Los planes futuros incluyen estudiar el patógeno que causa el SARS, que tampoco requiere un laboratorio BSL-4, antes de pasar al Ébola y el virus Lassa de África Occidental, que sí lo hacen. Aproximadamente un millón de chinos trabajan en África; el país debe estar preparado para cualquier eventualidad, dice Yuan. "Los virus no conocen fronteras".​

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El plan de expandirse a una red aumenta tales preocupaciones. Un laboratorio BSL-4 en Harbin ya está esperando la acreditación; Se espera que los dos siguientes estén en Beijing y Kunming, este último enfocado en el uso de modelos de monos para estudiar enfermedades.​

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Lina dice que el tamaño de China justifica esta escala, y que la oportunidad de combinar la investigación BSL-4 con una gran cantidad de monos de investigación (los investigadores chinos enfrentan menos trámites burocráticos que los de Occidente cuando se trata de investigar primates) podría ser poderosa. "Si desea probar vacunas o antivirales, necesita un modelo de primates no humanos", dice Lina.​

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Pero Ebright no está convencido de la necesidad de más de un laboratorio BSL-4 en China continental. Sospecha que la expansión allí es una reacción a las redes en Estados Unidos y Europa, que dice también son injustificadas. Agrega que los gobiernos asumirán que tal exceso de capacidad es para el desarrollo potencial de armas biológicas.​

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"Estas instalaciones son inherentemente de doble uso", dice. La perspectiva de aumentar las oportunidades para inyectar patógenos a los monos también le preocupa, en lugar de excitarlo: "Pueden correr, pueden rascarse, pueden morder".​

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Trevan dice que la inversión de China en un laboratorio BSL-4 puede, sobre todo, ser una forma de demostrarle al mundo que la nación es competitiva. "Es un gran símbolo de estatus en biología", dice, "ya sea que sea una necesidad o no".​

Curiosamente, además de Wuhan, el gobierno chino planeó abrir un nuevo laboratorio BSL-4 en Kunming, con miras a probar vacunas en primates. Como recordará, Kunming no es solo la capital de Yunnan, sino que también es donde Shi Zhengli encontró las cepas Rs3367 y RsSHC014 en cuevas cercanas. Por cierto, Baric y Shi Zhengli mencionaron las pruebas con primates como posibles próximos pasos para el desarrollo de vacunas preventivas contra posibles brotes futuros de coronavirus en su famoso artículo de 2015:

Sin embargo, se requieren más pruebas en primates no humanos para traducir estos hallazgos en potencial patógeno en humanos. Es importante destacar que el fracaso de las terapias disponibles define una necesidad crítica de estudios adicionales y de desarrollo de tratamientos. Con este conocimiento, se pueden producir programas de vigilancia, reactivos de diagnóstico y tratamientos efectivos que protejan contra la aparición de CoV específicos del grupo 2b, como SHC014, y estos se pueden aplicar a otras ramas de CoV que mantienen grupos igualmente heterogéneos.​

Tal vez para 2019 la creación y prueba de posibles vacunas contra varios coronavirus similares al SARS ya estuviera en pleno apogeo.

Cuidado con el laboratorio

Echemos ahora un vistazo a la hipótesis de la fuga de laboratorio. Pero primero, proporcionaré un contexto histórico, incluidas las filtraciones de laboratorio confirmadas anteriormente, como muchas de las que sucedieron antes. En primer lugar, las filtraciones de laboratorio del primer SARS-CoV: inicialmente, en el verano de 2003 en Singapur (https://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa032565), luego en diciembre de 2003 en Taiwán (SARS Case Confirmed in Taiwan) y en la primavera de 2004 dos veces en Beijing (SARS escaped Beijing lab twice).

Hubo escalas en Europa y EEUU, aunque afortunadamente no se produjeron infecciones allí. Por ejemplo, un laboratorio francés una vez perdió viales con SARS (French Lab Loses SARS Vials), y un laboratorio estadounidense BSL-4 en Texas perdió un vial que contenía Guanarito (virus de la fiebre hemorrágica venezolana) (FBI Gets Case of Missing Virus at Texas Biolab):

Solo un científico trabajó con el virus, y Reyes dijo que el laboratorio sospecha que el científico tiró el frasco accidentalmente en noviembre.​

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El biolab de Galveston requiere las medidas de seguridad más estrictas porque estudia materiales de nivel BSL-4 de bioseguridad o enfermedades infecciosas peligrosas que no tienen vacunas ni curas. Los materiales BSL-4 incluyen Guanarito, Ébola y viruela.​

La historia conoce otras fugas a una escala mucho mayor (https://armscontrolcenter.org/wp-content/uploads/2016/02/Escaped-Viruses-final-2-17-14-copy.pdf). Por ejemplo, la "resurrección" del virus de la gripe H1N1 en 1977, que anteriormente se consideraba extinto. Sí, este es el virus de la famosa "gripe española":

Los virus de la influenza humana H1N1 aparecieron con la pandemia de 1918 y persistieron, ralentizando la acumulación de pequeños cambios en su genoma (con un cambio importante en 1947), hasta que apareció la gripe "asiática" H2N2 en 1957, provocando una pandemia mundial. El virus de la influenza H1N1 aparentemente se extinguió y no se aisló durante 20 años. En 1969, el virus H3N2 de "Hong Kong" reemplazó al virus H2N2 y todavía está circulando.​

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En septiembre de 1977 se aisló un virus de influenza H1N1 de infecciones humanas en la región del Lejano Oriente de la Unión Soviética, y a principios de 1978 los chinos informaron que habían aislado el virus H1N1 en mayo de 1977 en el noreste de China adyacente al brote soviético. Utilizando las primeras herramientas genéticas disponibles en ese momento, se descubrió que el virus H1N1 de 1977 estaba estrechamente relacionado con los virus de la influenza humana H1N1 que circulaban en 1949-1950, pero no con los que circulaban antes o después.​

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Solo desde 2009-2010, los principales artículos comenzaron a afirmar directamente que la aparición de la influenza H1N1 en 1977 fue una publicación relacionada con el laboratorio: "El caso más famoso de una cepa de laboratorio liberada es el virus de la influenza A H1N1 reemergente que se observó por primera vez en China en Mayo de 1977 y en Rusia poco después".​

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La especulación de que la liberación de 1977 pudo haber estado relacionada con la investigación de la vacuna H1N1 está respaldada por la observación de que en los brotes iniciales en China, nueve de los diez aislamientos virales expresaron "sensibilidad a la temperatura" (Kung, 1978). La sensibilidad a la temperatura normalmente es un rasgo poco común, pero que fue en la década de 1970 (y sigue siendo) un rasgo fundamental para fabricar vacunas contra la influenza vivas atenuadas. La sensibilidad a la temperatura generalmente ocurre solo después de una serie de manipulaciones y selecciones sustanciales de laboratorio.​

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Curiosamente, una investigación adicional indicó que las cepas circulantes en 1977-78 a menudo estaban compuestas por componentes mixtos sensibles a la temperatura y normales, y que la sensibilidad a la temperatura aparentemente desapareció rápidamente del linaje H1N1 posterior a 1978. El escape de una población de medio protocolo de virus H1N1 sometida a selección de laboratorio para mutantes sensibles a la temperatura proporcionaría una población tan mixta. En 1976–77, el personal de laboratorio en su adolescencia o principios de los 20 no habría estado expuesto a los virus de la influenza H1N1 anteriores a 1957 y habría sido susceptible a las infecciones de laboratorio. La baja gravedad de la pandemia de 1977 podría deberse en parte a la sensibilidad del virus a la temperatura, un rasgo que limita la replicación del virus en los tejidos pulmonares.​

Parece que la creación de mutantes virales sensibles a la temperatura para desarrollar vacunas potencialmente atenuadas se generalizó a finales del siglo XX. Si recuerda, en 1990, el propio Ralph Baric también experimentó con la creación de cepas de coronavirus sensibles a la temperatura (https://link.springer.com/content/pdf/10.1007/978-1-4684-5823-7_47.pdf).

¿Podría algo como esto haber causado la pandemia de Covid-19? Son posibles varias opciones, desde una fuga durante el desarrollo de una posible vacuna hasta la investigación fundamental sobre la recombinación en laboratorio de los virus del murciélago y del pangolín. Algún investigador particularmente ambicioso podría incluso decidir combinar los dos "temas de investigación de moda": agregar un sitio furin y trasplantar RBM de una cepa de una especie (pangolín) a otra (murciélagos), para que luego, se confirme la mayor virulencia del nuevo virus quimérico, pueden volverse poéticos sobre los peligros de la misma recombinación que ocurre en las cuevas de Yunnan o en los mercados húmedos. Y si tal investigador pudiera siquiera desarrollar de manera preventiva una vacuna contra esta y otras quimeras potenciales, podrían esperar todo tipo de elogios.

¿Estoy diciendo entonces que esto es lo que pasó? Por supuesto que no, no pretendo saber qué pasó. Hoy, no hay evidencia de esto. Por ahora, solo hay una serie de extrañas coincidencias, por ejemplo, que el brote del coronavirus de Yunnan ocurrió a miles de kilómetros de Yunnan en un mercado húmedo más cercano al Wuhan Institute of Virology. O tal vez no en el mercado húmedo, ya que 3 de los primeros 4 pacientes no tenían vínculos con el mercado (Wuhan seafood market may not be source of novel virus spreading globally). Además, existen coincidencias en las características estructurales del genoma de CoV2, que se asemejan a manipulaciones que los virólogos han realizado repetidamente en el laboratorio. Pero la coincidencia no es una prueba.

Además, ocurren coincidencias, y CoV2, obviamente, podría haber surgido de forma natural. Todavía no está claro exactamente cómo, para esto, las cepas de murciélago y pangolín deben haberse encontrado en la misma celda de algún animal en Wuhan, ya que el brote ocurrió allí (de lo contrario, habríamos visto otros brotes a lo largo del camino que el animal habría tomado para llegar a Wuhan). Dado que los murciélagos no se vendieron en el mercado de Wuhan (DEFINE_ME), y generalmente hibernan en esta época del año, y que aún no se han identificado otros portadores de cepas ancestrales, el escenario exacto de emergencia natural sigue siendo un misterio.

En el lado opuesto de la balanza, dando crédito a la hipótesis del laboratorio, hay informes de que en 2018, los expertos estadounidenses se alarmaron bastante después de su visita al Wuhan Institute of Virology y la conversación con Shi Zhengli. Su "gira de laboratorio" resultó en dos despachos diplomáticos a Washington en los que señalaron una serie de debilidades de seguridad:

Fuentes familiarizadas con los cables dijeron que estaban destinados a hacer sonar una alarma sobre las graves preocupaciones de seguridad en el laboratorio de WIV, especialmente con respecto a su trabajo con los coronavirus de murciélago. Los funcionarios de la embajada estaban pidiendo más atención de Estados Unidos a este laboratorio y más apoyo para él, para ayudarlo a solucionar sus problemas.​

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"Durante las interacciones con los científicos en el laboratorio de WIV, notaron que el nuevo laboratorio tiene una grave escasez de técnicos e investigadores debidamente capacitados necesarios para operar de manera segura este laboratorio de alta contención", afirma el cable del 19 de enero de 2018, que fue redactado por dos funcionarios de las secciones de medio ambiente, ciencia y salud de la embajada que se reunieron con los científicos de WIV. (El Departamento de Estado se negó a comentar sobre este y otros detalles de la historia).​

 

[Despistado3 (versión3.0)]

Continuación (XI).

22.04.2020

Escribe Yuri Deigin.

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¿Hecho en laboratorio? Genealogía del SARS-CoV-2 a través de la lente de la investigación de ganancia de función

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Los investigadores chinos de WIV estaban recibiendo asistencia del Galveston National Laboratory en el University of Texas Medical Branch y otras organizaciones estadounidenses, pero los chinos solicitaron ayuda adicional. Los cables argumentaban que Estados Unidos debería brindar más apoyo al laboratorio de Wuhan, principalmente porque su investigación sobre los coronavirus de murciélagos era importante pero también peligrosa.

Es algo irónico que el laboratorio de Wuhan haya recibido orientación del laboratorio de Texas en Galveston, que en un momento había perdido un frasco con un virus Guanarito (FBI Gets Case of Missing Virus at Texas Biolab): los especialistas de Wuhan se capacitaron en Galveston, que incluso se informó en el propio boletín del Wuhan Institute (aunque esa publicación ha sido eliminada del sitio web de WIV, pero todavía está disponible en Wayback Machine) (Wayback Machine):

Un par de toques finales al retrato familiar de las fugas de laboratorio: en noviembre de 2019, se produjo un brote de brucelosis (una infección bacteriana) en dos centros de investigación en Lanzhou, China, que infectó a más de 100 investigadores que trabajaban allí (Chinese institutes investigate pathogen outbreaks in lab workers). Los laboratorios estadounidenses tampoco han sido inmunes a los brotes, aunque no en la misma escala:

28.05.2015​

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Escriben Alison Young y Nick Penzenstadler.​

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Inside America's secretive biolabs​

Inside America's secretive biolabs​

¿Posibles sellos distintivos del origen del laboratorio?

Volvamos ahora nuestra atención al virus mismo. ¿Tiene signos obvios de manipulación en el laboratorio? Primero, algunas palabras sobre lo que significa "obvio". Cualquier mutación puede surgir de forma natural, e incluso si el inserto de aminoácido que había creado el sitio de furina en CoV2 no fuera "PRRA" sino "MADEINWVHANPRRA", todavía habría una posibilidad distinta de cero de que surgiera por accidente. Pero para nosotros, y para cualquier tribunal, creo que esto sería suficiente para probar el origen del laboratorio más allá de toda duda razonable.

El principal problema con tal evidencia es que incluso en un virus fabricado en laboratorio, simplemente puede que no exista. Básicamente, un buen ingeniero genético puede crear un virus sintético que sería indistinguible de uno natural. Además, a menudo los investigadores introducen deliberadamente algunas mutaciones sinónimas en sus diseños para que luego puedan distinguir su cepa de las naturales. Pero si los creadores optan por no revelar estos marcadores, es imposible distinguirlos de las mutaciones naturales.

Pero a veces pueden quedar rastros de manipulación, especialmente si los creadores no intentan ocultarlos. En primer lugar, estoy hablando de los puntos en el genoma del virus donde se corta su ADN (recuerde que las manipulaciones del virus de ARN se llevan a cabo en construcciones de ADN complementarias) (Complementary DNA - Wikipedia). Esto ocurre cuando los creadores de virus necesitan cortar un segmento o unir nuevos segmentos. Después de todo, el ADN no se puede cortar en lugares arbitrarios (aparte de CRISPR), sino solo donde su secuencia de nucleótidos (generalmente de 4 a 6 "letras") forma una secuencia reconocida por alguna enzima de restricción (Сайт рестрикции — Википедия), es decir, una enzima que puede cortar una cadena de nucleótidos. Sin embargo, este análisis se complica por el hecho de que existen cientos de tipos diferentes de enzimas de restricción que se utilizan en ingeniería genética. Pero intentémoslo de todos modos.

Como referencia, aquí hay un ejemplo del trabajo del grupo Baric de 2008, donde tomaron Bat-SCoV y reemplazaron su RBD por un RBD de SARS humano (A Mouse-Adapted SARS-Coronavirus Causes Disease and Mortality in BALB/c Mice). Así es como describen la creación de su quimera:

Representación química de las variantes de SARS-CoV y Bat-SCoV. (A) Representación esquemática de los genomas de SARS-CoV y Bat-SCoV (número de acceso de GenBank FJ211859) y el sistema de genética inversa. (Arriba) Las puntas de flecha indican los sitios de procesamiento de nsp dentro de la poliproteína ORF1ab (puntas de flecha abiertas, mediadas por proteinasa similar a papaína; puntas de flecha rellenas, mediadas por nsp5 [proteinasa similar a 3C]). Inmediatamente debajo están los fragmentos usados en el sistema de genética inversa, etiquetados de la A a la F. Los fragmentos sintetizados para generar Bat-SCoV recapitulan exactamente las uniones de fragmentos de SARS-CoV con la excepción de que el Bat-SCoV tiene 2 fragmentos, Bat-E1 y Bat-E2, que corresponden al fragmento SARS-E.

Como puede ver, el grupo Baric creó primero un clon sintético de Bat-SCoV con el mismo patrón que usaron para su clon sintético de SARS-CoV. Es decir, para el clon de murciélago, usaron los mismos 6 segmentos con los mismos sitios de enzimas de restricción que habían usado anteriormente para el SARS-CoV, lo que les permitió intercambiar segmentos de virus entre diferentes cepas como piezas de Lego. Aquí está su descripción detallada:

Los virus que contienen inserciones generadas por PCR dentro de la secuencia de codificación viral se produjeron utilizando la estrategia de ensamblaje de SARS-CoV (24, 33, 53) con las siguientes modificaciones. En resumen, para el virus Bat-F, se construyó ADNc de longitud completa ligando productos de restricción de los fragmentos A-E del SARS-CoV y el fragmento F del Bat-SCoV, que requirió una digestión con BglI-NotI. Para Bat-SCoV y Bat-SRBD, Bat-SRBM y Bat-Hinge, los plásmidos que contienen los 7 fragmentos de ADNc del genoma de Bat-SCoV se digirieron utilizando BglI para Bat-A, Bat-B, Bat-C y Bat -D, BglI y AflII para Bat-E1 y Bat-E2, y BglI y NotI para Bat-F. Los fragmentos digeridos y purificados en gel se ligaron juntos simultáneamente. La transcripción se llevó a cabo mediante el uso de un kit T7 mMessage mMachine (Ambion), y el ARN se sometió a electroporación en células Vero (24, 53).​

Todas estas abreviaturas de tres letras (BglI, AflII, NotI, etc.) en la oración resaltada anteriormente son diferentes tipos de enzimas de restricción. Veamos si hay alguna diferencia en los sitios de las enzimas de restricción en la secuencia de la proteína de pico de la quimera en comparación con el genoma del SARS-CoV original (Recombinant coronavirus clone Bat-SRBD spike glycoprotein gene, comple - Nucleotide - NCBI):

Como puede verse, los sitios de las enzimas de restricción de la quimera son casi idénticos a los de las secuencias originales en Bat-SCoV o SARS de donde se tomaron. Las únicas diferencias se notan en los sitios de "costura" de la pieza insertada del SARS. Aquí, por ejemplo, está el borde izquierdo (5'-) del inserto:

Aquí, Bat-SCoV y SARS resultaron tener una región idéntica común de nucleótidos (la intersección de las regiones cian y rosa), y no hay nuevos sitios de enzimas de restricción en el sitio de unión de las dos secuencias, por el contrario, el sitio SspI del SARS desapareció. Y aquí está el borde derecho (3'-) del inserto:

Aquí, por el contrario, todos los sitios de enzimas de restricción originales permanecen en el sitio de ligación, e incluso aparecen otros nuevos, por ejemplo, EcoRII. Si no hubiera sabido que el genoma quimérico es el resultado de manipulaciones de laboratorio, ¿podría deducirlo mirando estas 3 secuencias? En realidad, no, e incluso si surgiera alguna sospecha, ciertamente no estaría más allá de una duda razonable. Quizás sería obvio para los especialistas en ingeniería genética por otros signos, y, de ser así, espero que hablen.

 

[Despistado3 (versión3.0)]

Continuación (XII).

22.04.2020

Escribe Yuri Deigin.

Lab-made? CoV2 genealogy through the lens of gain-of-function research
Lab-Made? SARS-CoV-2 Genealogy Through the Lens of Gain-of-Function Research

¿Hecho en laboratorio? Genealogía del SARS-CoV-2 a través de la lente de la investigación de ganancia de función

Spoiler

Pero en cualquier caso, comparemos la proteína RaTG13spike con CoV2 y pangolin-2019. En caso de que algo salte.

Así es como se ven el RBD (resaltado en verde claro) y el RBM (amarillo) para los tres:

Entonces, ¿algo interesante? Bueno, noté algunos nuevos sitios de enzimas de restricción en CoV2 marcados con rectángulos rojos: coinciden con mutaciones únicas en la secuencia de aminoácidos (también marcados con rectángulos rojos en las secuencias de aminoácidos en el extremo derecho). Por si acaso, destaqué varios otros sitios nuevos: rectángulos azules y un rectángulo verde ubicado en la región del único aminoácido que difiere entre los RBM de CoV2 y pangolin-2019.

Comparemos ahora el tramo alrededor del inserto PRRA que creó el sitio furin en CoV2 entre esas tres cepas:

Aquí, también, han aparecido varios nuevos sitios de restricción (resaltados en azul) a ambos lados del nuevo inserto. ¿Podrían haber sido utilizados para crear un sitio furin? Teóricamente, sí. Alternativamente, la inserción podría haberse realizado a través de sitios existentes o incluso utilizando el método de ligación "sin fisuras", es decir, mediante la creación de segmentos con nuevos sitios de restricción que desaparecen después de que se unen los extremos complementarios. Quizás recuerdes que el grupo Baric aplicó esta tecnología en 2002 para crear un clon sintético de coronavirus murino (Systematic Assembly of a Full-Length Infectious cDNA of Mouse Hepatitis Virus Strain A59):

Las uniones de los sitios de restricción de interconexión que se encuentran en los extremos de cada ADNc se eliminan sistemáticamente durante el ensamblaje del producto completo de ADNc de longitud completa, lo que permite el reensamblaje sin la introducción de cambios de nucleótidos.​

En 2003, volvieron a utilizar este enfoque para un clon sintético de SARS-CoV (Reverse genetics with a full-length infectious cDNA of severe acute respiratory syndrome coronavirus):

Para ensamblar rápidamente clones de consenso, usamos endonucleasas de restricción de clase IIS que cortan en sitios asimétricos y dejan extremos asimétricos. Estas enzimas generan proyecciones únicas específicas de la hebra que permiten la ligación perfecta de dos ADNc con la pérdida concomitante del sitio de restricción.​

Hoy en día, las técnicas de manipulación genética son tan avanzadas y se han vuelto tan rutinarias que el artículo de Beijing de octubre de 2019 (The S2 Subunit of QX-type Infectious Bronchitis Coronavirus Spike Protein Is an Essential Determinant of Neurotropism), que había insertado un nuevo sitio furin en el coronavirus del pollo, solo dedicó un par de oraciones a su metodología:

2.2. Generación de virus recombinantes​

​

El virus rYN-S2 / RRKR recombinante que contiene una proteína S con el sitio furin-S2 'fue generado por recombinación de vaccinia, como se describió anteriormente [20, 28]. Brevemente, se generó el plásmido con el sitio furin-S2 'usando el kit Seamless Assembly (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) Y se transfectó en células CV-1 infectadas por virus vaccinia que contenían el genoma de YN-ΔS-GPT. El sitio Furin-S2 'se introdujo en el ADNc de YN mediante recombinación homóloga utilizando el sistema de selección dominante transitorio [25].​

El ritmo del progreso en la ingeniería genética es asombroso. Aquí hay una descripción sobre el Seamless Assembly kit (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A13288#/A13288):

El kit GeneArt® Seamless Cloning and Assembly permite la clonación simultánea y direccional de 1 a 4 fragmentos de PCR, que constan de cualquier secuencia, en cualquier vector linealizado, en una única reacción a temperatura ambiente de 30 minutos. El kit contiene todo lo necesario para el ensamblaje de fragmentos de ADN y su transformación en E. coli para la selección y crecimiento de vectores recombinantes.​

​

• Velocidad y facilidad: clone hasta 4 fragmentos de ADN, con la secuencia de su elección, simultáneamente en un solo vector (hasta 13 Kb); no se requieren sitios de restricción de digestión, ligación o recombinación​

• Precisión y eficiencia: diseñado para permitirle clonar lo que desee, donde desee, en la orientación que desee, y lograr hasta un 90% de clones correctos sin dejar secuencias adicionales.​

• Flexibilidad de vectores: utilice nuestro vector lineal o un vector de su elección​

• Herramientas gratuitas: diseñe oligonucleótidos de ADN y más con nuestra interfaz web gratuita que lo guiará paso a paso a través de su proyecto.​

• Diversas aplicaciones: simplifique muchas técnicas de biología sintética y biología molecular mediante la combinación, adición, eliminación o intercambio rápido de segmentos de ADN.​

Se pueden unir hasta 4 fragmentos de ADN en la orientación deseada en aproximadamente media hora, sin tener que lidiar con enzimas de restricción o ligación. Una vez que haya terminado, "cargue" rápidamente su creación en E. coli para propagar el diseño resultante. ¡Pan comido!

En resumen, el análisis del sitio de la enzima de restricción no arrojó nada concluyente. Sin embargo, señaló que no solo CoV2 es bastante único, sino que también lo es RaTG13, y deberíamos seguir investigando los orígenes de ambos.

Preferencias de codones

Para estos propósitos, decidí echar un vistazo al sesgo de uso de codones (https://www.bioinformatics.org/sms2/codon_usage.html) para verificar qué cepas se parecen más a CoV2 y RaTG13. Se sabe que los virus tienden a adaptar su firma de codones (https://en.wikipedia.org/wiki/Codon_usage_bias) a las preferencias de sus anfitriones, por lo que esperaba ver que RaTG13 exhibiera un patrón similar a otros virus de murciélago, y también esperaba ver una diferencia con las cepas de pangolín.

El SARS-CoV, por ejemplo, es muy similar a Rs3367 y RsSCH014, como cabría esperar:

Entre ellos, por cierto, el SARS, MERS y CoV2 difieren:

RaTG13 es similar a CoV2, lo que también es de esperar:

 

[Despistado3 (versión3.0)]

Continuación (XIII).

22.04.2020

Escribe Yuri Deigin.

Lab-made? CoV2 genealogy through the lens of gain-of-function research
Lab-Made? SARS-CoV-2 Genealogy Through the Lens of Gain-of-Function Research

¿Hecho en laboratorio? Genealogía del SARS-CoV-2 a través de la lente de la investigación de ganancia de función

Spoiler

Pero RaTG13 en realidad no está tan cerca de las cepas de pangolín, y las cepas de pangolín no son exactamente idénticas entre sí:

RaTG13 también se diferencia de ZXC21 y ZC45:

En cuanto a las cepas de Yunnan, RaTG13 está bastante lejos de Rs3367 y RsSCH014, y más cerca de LYRa11, pero también con diferencias notables:

En general, como antes, RaTG13 y CoV2 se destacan en una clase propia. También me intrigó el codón AAA: lo usan con mucha más frecuencia que sus cepas compañeras:

Probablemente esta sea solo otra coincidencia, pero se observa una proporción similar entre AAA y AAG en E. coli (Codon Usage). ¿Puede cambiar la firma del codón del ADNc si se cultiva durante mucho tiempo en cultivo celular? Tal vez, pero todavía no he profundizado en este tema.

[ACTUALIZADO] También decidí verificar los patrones de uso de codones entre RaTG13 y otras cepas de Ra recolectadas del mismo pozo de mina abandonado en Mojiang, donde en 2013 el grupo de Shi Zhengli encontró la cepa RaBtCoV/4991 (KP876546) (Coexistence of multiple coronaviruses in several bat colonies in an abandoned mineshaft - PubMed) (Rhinolophus bat coronavirus BtCoV/4991 RNA-dependent RNA polymerase (R - Nucleotide - NCBI) que comparte un segmento RdRp de 370 pb idéntico con RaTG13 . Desafortunadamente, solo los segmentos de 816 pb del gen RdRp estaban disponibles para las otras cepas Ra (RaBtCoV/3750 [Bat coronavirus RaBtCoV/3750 RNA dependent RNA polymerase gene, partia - Nucleotide - NCBI] y RaBtCoV/4307-2 [Bat coroanvirus RaBtCoV/4307-2 RNA dependent RNA polymerase gene, part - Nucleotide - NCBI]), por lo que extraje el segmento de 816 pb correspondiente de RaTG13 con el propósito de comparar el uso de codones (Bat coronavirus RaTG13, complete genome - Nucleotide - NCBI). RaTG13 nuevamente difirió sustancialmente, mientras que las otras dos cepas se agruparon juntas:

Por lo tanto, el análisis de codones tampoco reveló signos obvios de orígenes de laboratorio, pero una vez más confirmó la singularidad de CoV2 y RaTG13. ¿Qué nos deja esto? Hasta ahora, solo una serie de rarezas que, como les gusta decir a los científicos, tomadas en conjunto, no nos permiten rechazar la hipótesis del origen de laboratorio de CoV2.

La revista Nature frente a la hipótesis elaborada en laboratorio

¿Pero no refutó ese artículo de Nature (https://www.nature.com/articles/s41591-020-0820-9) la hipótesis elaborada en el laboratorio? No en realidad no. No hay evidencia irrefutable en su contra en el artículo, solo un fuerte "no lo creemos" basado en una base inestable. Juzgue usted mismo, estos son los argumentos clave de los autores en apoyo de sus conclusiones:

Si bien los análisis anteriores sugieren que el SARS-CoV-2 puede unirse a ACE2 humano con alta afinidad, los análisis computacionales predicen que la interacción no es ideal y que la secuencia RBD es diferente de las que se muestran en el SARS-CoV como óptima para la unión al receptor. Por tanto, la unión de alta afinidad de la proteína espiga del SARS-CoV-2 a la ACE2 humana es muy probablemente el resultado de la selección natural en una ACE2 humana o similar a la humana que permite que surja otra solución de unión óptima. Esta es una fuerte evidencia de que el SARS-CoV-2 no es producto de una manipulación intencionada.​

En el artículo original, las oraciones citadas están justo debajo del diagrama que muestra RBM idénticas entre CoV2 y pangolin-2019. De modo que me desconcierta qué tiene que ver el "análisis computacional" con cualquier cosa. Obviamente, el escenario más probable para la hipótesis de laboratorio es la transferencia de RBM de una cepa a otra, lo que los virólogos han hecho muchas veces antes. Por lo tanto, la cadena de argumentos del autor no tiene sentido: “la computadora dice que la unión no es ideal, por lo que CoV2 debe ser el resultado de la selección natural. Ergo, esta es una fuerte evidencia de que CoV2 no está fabricado en laboratorio". Espere, el hecho de que CoV2 difiera de algún virus "óptimo" no significa que no se haya podido crear en un laboratorio. No es el laboratorio que intenta crear armas biológicas "óptimas", sino un laboratorio que crea quimeras de cepas encontradas naturalmente, por ejemplo, en murciélagos y pangolines.

Los autores siguen sorprendiendo:

Además, si se hubiera realizado manipulación genética, probablemente se habría utilizado uno de los varios sistemas de genética inversa disponibles para los betacoronavirus. Sin embargo, los datos genéticos muestran de manera irrefutable que el SARS-CoV-2 no se deriva de ninguna columna vertebral de virus previamente utilizada.​

Una vez más, la misma lógica cuestionable vestida con adjetivos categóricos: "¡el análisis genético prueba irrefutablemente que CoV2 no se creó sobre la base de cepas previamente conocidas!" Bueno, gracias, Capitán Obvio. Pero, ¿por qué los creadores potenciales de CoV2 no podrían hacer una columna vertebral de ADNc a partir de cepas no publicadas relacionadas o incluso derivadas de RaTG13? Luego, podrían insertar fácilmente el RBM de pangolín en él, así como agregar un sitio furin (o tal vez la columna vertebral del ADNc ya tenía uno). Los virólogos han estado haciendo cosas como esta durante 20 años, y las herramientas modernas de ingeniería genética hacen que tales manipulaciones sean accesibles incluso para un estudiante de posgrado.

En cuanto a las posibilidades de que surja el sitio furin en el cultivo celular, los autores también expresan ideas extrañas:

La adquisición tanto del sitio de escisión polibásico como de los glicanos ligados a O predichos también argumenta en contra de los escenarios basados en cultivos. Se han observado nuevos sitios de escisión polibásica solo después del paso prolongado del virus de la influenza aviar de baja patogenicidad in vitro o in vivo. Además, una generación hipotética de SARS-CoV-2 por cultivo celular o pase animal habría requerido el aislamiento previo de un virus progenitor con una similitud genética muy alta, lo que no se ha descrito. La generación posterior de un sitio de escisión polibásico habría requerido entonces repetidos pases en cultivos celulares o animales con receptores ACE2 similares a los de los seres humanos, pero dicho trabajo tampoco se ha descrito previamente.​

En primer lugar, los propios autores citan trabajos anteriores en los que el sitio furin surgió in vitro a medida que se cultivaban virus en las células. Y en segundo lugar, ¿qué significan, no se ha descrito una cepa con alta similitud genética? ¿Qué pasa con RaTG13? Si se hubiera reemplazado su RBM por una de la cepa de pangolín, y luego la cepa quimérica se cultivó in vitro, entonces el sitio furin bien podría haber surgido en este asunto. Además, la nueva cepa podría adquirir otras mutaciones que distinguen a CoV2 de RaTG13 y pangolin-2019.

Pero en términos del origen potencial basado en laboratorio del sitio furin, me inclino más a hipotetizar una inserción específica, como en el documento de Beijing de octubre de 2019 con el coronavirus de pollo (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6832359/). Después de eso, la cepa sintética podría haber adquirido nuevas mutaciones mediante el cultivo posterior in vitro o in vivo, como la cepa murina MA15 en 2007, por ejemplo (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1769406/). O tal vez incluso usando el mismo modelo de ratón con tejidos pulmonares humanizados y sistema inmunológico que fue creado en la UNC por Baric y otros grupos en 2018, en el que informaron haber probado varios virus, incluido el MERS (https://www.nature.com/articles/s41587-019-0225-9):

El sistema inmunológico innato y adaptativo humano de los ratones BLT-L​

​

Generamos un modelo in vivo con implantes pulmonares humanos y un sistema inmunológico humano autólogo mediante la construcción de ratones BLT con implantes pulmonares humanos autólogos (ratones BLT-L humanizados).​

Finalmente, incluso si CoV2 es producto de la selección en lugar de un diseño inteligente, eso tampoco descarta una fuga de laboratorio: la selección puede ocurrir en el laboratorio igualmente, tanto de tipo natural como artificial. Diferentes cepas pueden recombinarse en animales de investigación o in vitro por diseño o por casualidad.

 

[Despistado3 (versión3.0)]

Continuación (XIV y último).

22.04.2020

Escribe Yuri Deigin.

Lab-made? CoV2 genealogy through the lens of gain-of-function research
Lab-Made? SARS-CoV-2 Genealogy Through the Lens of Gain-of-Function Research

¿Hecho en laboratorio? Genealogía del SARS-CoV-2 a través de la lente de la investigación de ganancia de función

Spoiler

Sobre la diferencia del genoma del 4% entre RaTG13 y Cov2

Algunos críticos de la hipótesis elaborada en el laboratorio afirman que la diferencia genética observada de ~ 4% entre RaTG13 y CoV2 es demasiado alta para haber ocurrido posiblemente en un laboratorio si el propio RaTG13 se usara como columna vertebral. Las tasas de mutación observadas para los virus de ARN varían ampliamente (Mutation Rate - an overview | ScienceDirect Topics): de 10⁻⁶ a 10⁻⁴ nucleótidos por replicación in vitro, y en humanos, CoV2 parece mutar a una tasa de 25 mutaciones por año. Por lo tanto, según la lógica, se necesitarían años, si no décadas, para que dos cepas divergieran en un 4%. Si bien ese es un punto válido, hay varios problemas con esa línea de razonamiento.

Primero, las velocidades de mutación in vitro (es decir, por unidad de tiempo) son mucho más altas, ya que puede pasar células con mucha más frecuencia que infectar a nuevos animales. Como demostraron los experimentos in vitro de SARS y MERS, se pueden observar mutaciones significativas después de solo unos pocos pases. Por ejemplo, el artículo de 2004 informó que solo después de 600 pases ya había una diferencia del 2.1% en las secuencias genómicas de las proteínas de punta entre la cepa original y su progenie (The N-Terminal Region of the Murine Coronavirus Spike Glycoprotein Is Associated with the Extended Host Range of Viruses from Persistently Infected Murine Cells):

Además, en presencia de algunos compuestos antivirales, como los análogos de nucleósidos (por ejemplo, ribavirina o remdesivir), las tasas de mutación en los virus de ARN pueden aumentar aún más (Effect of Ribavirin on the Mutation Rate and Spectrum of Hepatitis C Virus In Vivo):

Obtuvimos una estimación de la tasa de mutación espontánea de ca. 10⁻⁴ sustituciones por sitio o menos, un valor dentro del rango normalmente aceptado para los virus de ARN. Se observó un aumento de aproximadamente tres veces en la tasa de mutación y un cambio significativo en el espectro de mutación en muestras de pacientes sometidos a 6 meses de tratamiento con interferón más ribavirina. Este resultado es consistente con el conocido efecto mutagénico in vitro de la ribavirina y sugiere que el efecto antivírico del tratamiento con ribavirina más interferón se ejerce al menos en parte mediante mutagénesis letal.​

Entonces, si el CoV2 ancestral se estuviera probando en laboratorio para evaluar cómo su mutagénesis podría afectar la eficacia de posibles vacunas o medicamentos antivirales, podría haber acumulado mutaciones a una tasa mucho mayor.

Pero posiblemente, el mayor problema con el argumento de la diferencia del 4% es que se basa en que RaTG13 es exactamente lo que WIV dice que es. Si vamos a considerar seriamente la hipótesis de la fuga de laboratorio, debemos admitir que no tiene sentido confiar ciegamente en los datos publicados por el mismo laboratorio sospechoso de la fuga. Si la fuga ocurrió, como es la premisa de la hipótesis del laboratorio, entonces la descripción de lo que es RaTG13 podría promover el objetivo de cubrir la fuga.

Una vez más, no estoy afirmando con certeza que eso sea lo que ha sucedido aquí. Todo lo que digo es que esto es lo que podría haber sucedido, y necesitamos mucha más evidencia antes de que podamos llegar a una conclusión definitiva. Una cosa que podría ayudar a descartar la manipulación de RaTG13 es hacer que laboratorios independientes secuencien las muestras de Yunnan de 2013 de las que She Zhengli extrajo RaTG13. WIV aún debe tenerlos si re-secuenciaron RaTG13 en 2020.

Shi Zhengli-2020

Mientras escribía esta publicación, salió un nuevo artículo en coautoría de Shi Zhengli, en el que los autores probaron un péptido que habían estado estudiando durante algún tiempo antes contra CoV2. Ese péptido estaba destinado a ser un inhibidor de pan-coronavirus (A pan-coronavirus fusion inhibitor targeting the HR1 domain of human coronavirus spike), y su modo de acción diseñado era bloquear la fusión de una proteína de pico con una membrana celular. Los autores, por supuesto, mencionan el nuevo sitio furin de CoV2 y sugieren que puede desempeñar un papel importante en la penetración mucho más eficiente de CoV2 en la célula:

En este estudio, hemos demostrado que el SARS-CoV-2 exhibe una capacidad de fusión de membranas mucho mayor que el SARS-CoV, lo que sugiere que la maquinaria de fusión del SARS-CoV-2 es un objetivo importante para el desarrollo de inhibidores de fusión de coronavirus.​

​

...​

​

Generalmente, los coronavirus β-B carecen del sitio de reconocimiento de furina S1 / S2, y sus proteínas S no están escindidas en el estado nativo. Por ejemplo, el SARS-CoV entra en la célula principalmente a través de la vía de fusión de la membrana endosomal donde su proteína S es escindida por la catepsina L endosomal y activada. La inducción del sitio de reconocimiento de furina S1 / S2 podría aumentar significativamente la capacidad de la proteína SARS-CoV S para mediar en la infección de la superficie de la membrana celular.​

En este contexto, me pregunto si los autores han realizado previamente experimentos sobre cómo la adición de un sitio furin puede alterar la efectividad de su péptido (u otros medicamentos o vacunas) contra un coronavirus determinado.

Para no quedarse atrás, Ralph Baric también se unió a la carrera para encontrar drogas contra CoV2 (An orally bioavailable broad-spectrum antiviral inhibits SARS-CoV-2 and multiple endemic, epidemic and bat coronavirus). Según tengo entendido, él y sus coautores tomaron datos sobre la efectividad de su análogo de nucleósido (β-D-N4-hidroxicitidina, NHC) contra el SARS-CoV y MERS que ya tenían, agregaron algunos datos in vitro sobre CoV2 y enviaron del papel para imprimir. Los análogos de nucleósidos (como el famoso remdesivir [Remdesivir - Wikipedia]) son un enfoque fundamentalmente diferente al de Shi Zhengli et al. Aquí, los autores intentan prevenir la replicación viral dando letras "defectuosas" del alfabeto genético a la máquina copiadora del virus, mientras que Shi Zhengli y los coautores intentan evitar que el virus ingrese a la célula por completo. Teóricamente, estos enfoques podrían combinarse.

Este es el fin, estimado amigo

Si llegaste aquí leyendo en lugar de desplazándote, te lo recomiendo. Oye, incluso si te desplazaste, eso también es genial, y me disculpo por la verbosidad. Simplemente no anticipé que la madriguera del conejo se convertiría en todo un sistema de cuevas subterráneas. Espero que haya encontrado interesante esta inmersión profunda en el mundo de la virología y haya disfrutado de la exploración de la hipótesis CoV2 elaborada en laboratorio. En mi opinión, los datos que he presentado, tomados en conjunto, no nos permiten rechazar esta posibilidad.

Permítanme ser claro: esto NO prueba que CoV2 se sintetizó en el laboratorio. Sí, como hemos visto anteriormente, desde un punto de vista técnico, no sería difícil para un virólogo moderno crear tal cepa. Pero no hay evidencia directa de que alguien haya hecho esto, y las extrañas coincidencias no pueden pasar por evidencia circunstancial. A fin de cuentas, las posibilidades actuales en contra de esto son aún mayores que para los orígenes naturales de CoV2. Además, incluso si CoV2 fue realmente una desafortunada filtración de laboratorio, los científicos mismos no tienen la culpa, ya que estaban trabajando dentro de las leyes y pautas internacionales establecidas sobre dicha investigación. Ahora, aquellos que podrían estar tratando de encubrir esa filtración, esa es una historia diferente.

También vale la pena repetir el punto contrario: la hipótesis inversa sobre el origen exclusivamente natural del virus tampoco tiene pruebas contundentes. Hasta que no se encuentren antepasados intermedios entre RaTG13, pangolin-2019 y CoV2, en los que podamos rastrear la recombinación en mosaico que observamos en CoV2, la cuestión de sus orígenes permanece abierta. Para terminar, no hay nadie mejor para citar sobre este asunto que el propio Ralph Baric (This Week in Virology (TWiV) (non-exhaustive) transcript in English):

¿Cuál es la especie reservorio del SARS-CoV-2?​

​

No han identificado las especies reales del reservorio. Los informes muestran que los pangolines son potencialmente el hospedador intermediario, pero los virus de los pangolines son 88 a 98% idénticos al SARS-CoV-2. En comparación, las cepas de perros de algalia y mapache de los coronavirus del SARS eran 99,8% idénticas al SARS-CoV de 2003. En otras palabras, estamos hablando de un puñado de mutaciones entre las cepas de algalia, las cepas de perro mapache y las cepas humanas en 2003. Los pangolines [cepas de CoV2] tienen más de 3000 cambios de nucleótidos, de ninguna manera son la especie reservorio. Absolutamente ninguna posibilidad.​

Así que ahí lo tienes. Sigue siendo posible que el misterioso anfitrión del virus fuera un laboratorio:

¿Mal juego de palabras? Lo siento, el último.

Cómo aprendí a odiar al GOF

Espero que esta publicación no se use para culpar prematuramente o propagar teorías unilaterales. Lo que espero que destaque es la escala de investigación peligrosa de ganancia de función que ha estado y está sucediendo en virología. La pandemia de Covid-19 realmente expuso sus enormes riesgos frente a pocos beneficios: la investigación del GOF no nos ha protegido de este brote, no nos ha proporcionado ningún tratamiento o vacuna eficaz a tiempo para salvar cientos de miles de vidas perdidas debido al CoV2, y si hay una probabilidad del 0,1% de que la investigación de GOF haya causado todo, esa posibilidad es demasiado alta.

*


Muchas gracias por participar. Lo leeré con interés.

 

[Despistado3 (versión3.0)]

Otro artículo relacionado con el artículo citado de Yuri Deigin. Cautela con todas estas informaciones, esto es geopolítica pura y dura, guerra fría tecnológica y muy posiblemente la mierda abarca tanto a unos como a otros. Algunos desde países como Rusia, China o Irán señalan a EEUU.

14.02.2021

Escribe Lawrence Sellin, un coronel retirado del ejército de los EEUU.

The Chinese Military, its Links to U.S. Funding and the Laboratory Origin of COVID-19
El ejército chino, sus vínculos con la financiación estadounidense y el origen de laboratorio de la COVID-19

Traducción paco-Google.

El ejército chino, sus vínculos con la financiación estadounidense y el origen de laboratorio de la COVID-19

Spoiler

Según su biografía publicada en el sitio web del School of Basic Medical Sciences, Fudan University en Shanghai, China, el Dr. Shibo Jiang es profesor y director del Institute of Medical Microbiology (Basic Medical College of Fudan University).

Obtuvo su maestría y doctorado en medicina en la First y Fourth Medical University del Ejército de Liberación Popular (PLA), respectivamente.

En 1987-1990, recibió su formación postdoctoral en el Laboratory of Cellular Physiology and Immunology de la Rockefeller University de Nueva York.

De 1990 a 2010, trabajó en el Lindsley F. Kimball Research Institute del New York Blood Center como miembro asistente, miembro asociado, miembro y jefe del Viral Immunology Laboratory.

Desde 2010, ha trabajado como profesor en el Key Laboratory of Medical Molecular Virology, Shanghai Medical School, Fudan University (Shanghai, China).

Esa descripción no es precisa ni completa.

Los vínculos militares

Tan recientemente como el 3 de noviembre de 2020, en un artículo publicado junto a Peter J. Hotez del Baylor College of Medicine, Shibo Jiang indicó que su dirección profesional no es la Fudan University de China, sino el Lindsley F. Kimball Research Institute, New York Blood Center de Nueva York (NY, 10065, Estados Unidos) (Yeast-expressed SARS-CoV recombinant receptor-binding domain (RBD219-N1) formulated with aluminum hydroxide induces protective immunity and reduces immune enhancement).

Ese artículo se encuentra en la sección 'resultados' de la subvención de la investigación 4R01AI098775-05 por valor de 1,165,855 de dólares titulada "RBD [receptor binding domain] Recombinant Protein-Based SARS Vaccine For Biodefense" y otorgada por el dr. Anthony Fauci del National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID), en la cual Shibo Jiang figura como investigador principal.

Esa subvención de investigación incluye la colaboración con la University of Texas Medical Branch Galveston, sede del Center for Biodefense and Emerging Infectious Diseases, fundado por el Department of Defense (DoD) (University of Texas Medical Branch at Galveston & Moleculin Biotech Gear up for COVID-19 Research), que alberga una instalación de alta contención BL-4 para la investigación viral.

Los resultados de la subvención de investigación mencionada anteriormente se compartirían con el U.S. Army’s Walter Reed Army Institute of Research y, presumiblemente, también con el ejército chino.

En la sección 'resultados' también se encuentran artículos publicados por Shibo Jiang en colaboración con instituciones y científicos asociados con el PLA, así como con el Wuhan Institute of Virology, alegado por muchos, incluidos funcionarios del gobierno de EEUU, vomo el origen del COVID-19.

Un artículo de Shibo Jiang de 2016 titulado "A Recombinant Receptor-Binding Domain of MERS-CoV in Trimeric Form Protects Human Dipetidyl Peptidase 4 (HDPP4) Transgenic Mice from MERS-CoV Infection" (A recombinant receptor-binding domain of MERS-CoV in trimeric form protects human dipeptidyl peptidase 4 (hDPP4) transgenic mice from MERS-CoV infection) enumera como coautores a dos graduados de las PLA Military Medical Universities en China, Yusen Zhou y Guangyu Zhoa, que son sus científicos asociados desde hace mucho tiempo en el State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity, Institute of Microbiology and Epidemiology de Beijing, Academy of Military Medical Sciences (Beijing, China).

Un segundo artículo de 2017 titulado "Cross-Neutralization of SARS Coronavirus-Specific Antibodies Against Bat SARS-Like Coronaviruses" (Cross-neutralization of SARS coronavirus-specific antibodies against bat SARS-like coronaviruses) lo escribió junto Zheng-Li Shi, apodada "bat-woman", del Wuhan Institute of Virology.

De hecho, durante el período 1997-2016, cuando Shibo Jiang era investigador principal en subvenciones de investigación estadounidenses por más de 17 millones de dólares, la gran mayoría provenientes del NIAID de Fauci, también estaba recibiendo apoyo del gobierno chino y colaborando activamente con instituciones de investigación chinas, incluidas las del PLA.

Shibo Jiang y Yusen Zhou, de la Academy of Military Medical Sciences (Beijing, China) figuran como co-inventores en al menos ocho patentes de EEUU. Las referencias que respaldan esas patentes (The spike protein of SARS-CoV — a target for vaccine and therapeutic development), por ejemplo la 9889194 (US Patent for Immunogenic composition for MERS coronavirus infection Patent (Patent # 9,889,194 issued February 13, 2018) - Justia Patents Search), fueron investigaciones financiadas por el NIAID de Fauci (SARS-CoV S Protein Receptor-binding Domain-based Vaccines).

La colaboración de Shibo Jiang con el ejército de China es amplia.

En 2002, publicó un artículo sobre el virus Hantaan desde el Department of Microbiology de la Fourth Medical University del PLA (Xi’an, China) (The in vitro and in vivo protective activity of monoclonal antibodies directed against Hantaan virus: potential application for immunotherapy and passive immunization - PubMed).

También en 2002, Shibo Jiang publicó un artículo junto a su asociado desde mucho tiempo atrás, Shuwen Liu de la First Medical University del Key Lab for Drug Screening del PLA en Guangzhou, China, un estudio que fue financiado por la subvención R01 AI46221 del NIAID de Fauci (Identification of inhibitors of the HIV-1 gp41 six-helix bundle formation from extracts of Chinese medicinal herbs Prunella vulgaris and Rhizoma cibotte - PubMed).

En 2003, Shibo Jiang publicó un artículo desde el Department of Microbiology de la Fourth Military Medical University (Xi'an, China) (Automatic quantitation of HIV-1 mediated cell-to-cell fusion with a digital image analysis system (DIAS): application for rapid screening of HIV-1 fusion inhibitors).

En 2004, publicó otro artículo desde el Department of Microbiology de la Fourth Military Medical University (Xi’an, China) (Europe PMC) que lo llevó a su trabajo inicial con el ejército chino sobre la primera pandemia de SARS de 2002-2004.

En mayo de 2004, Shibo Jiang publicó un estudio sobre el SARS con la First Military Medical University (Guangzhou, China) (https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/path.1560) que fue financiado por subvenciones de la Chinese National Foundation of Natural Sciences (No 30340015), Military Foundation of Medical Science (No 03F016-2) y la Foundation of Natural Sciences de la provincia de Guangdong (No. GD2003‐80).

Entre 2005 y 2010, los artículos de investigación sobre el SARS de Shibo Jiang, realizados en colaboración con Yusen Zhou (State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity, Institute of Microbiology and Epidemiology de Beijing, Academy of Military Medical Sciences de Beijing) son demasiado numerosos para enumerarlos aquí, los cuales fueron financiados por el NIAID de Fauci.

En un artículo de 2014, Shibo Jiang estaba trabajando con el Institute of Biotechnology, Academy of Military Medical Sciences (Beijing, China) (Design,synthesis and activity evaluation of new anti-HIV-1 CXCR4 inhibitors--《Military Medical Sciences》2014年08期).

En 2017, Shibo Jiang realizó una investigación (Design,synthesis and activity evaluation of new anti-HIV-1 CXCR4 inhibitors--《Military Medical Sciences》2014年08期) con el Translational Medicine Center, el Hospital No. 454 del PLA y el Department of Epidemiology, Medicinal Research Institute, Nanjing Military Command.

Hasta su reciente muerte, la colaboración de Yusen Zhou con Shibo Jiang continuó en la pandemia de COVID-19, publicando un artículo en la revista Science el 30 de julio de 2020 (Adaptation of SARS-CoV-2 in BALB/c mice for testing vaccine efficacy | Science) junto con instituciones asociadas con el ejército de China.

De 2012 a 2020, Shibo Jiang publicó doce artículos científicos con el Wuhan Institute of Virology y once artículos entre 2013 y 2020 con la University of Texas Medical Branch (Galveston, Texas).

Durante el período entre la primera pandemia de SARS entre 2002-2004 y el brote de COVID-19 de 2019, Shibo Jiang también realizó una extensa investigación colaborativa con muchos de los principales laboratorios de investigación sobre coronavirus de EEUU, como su proyecto conjunto de 2015 con la University of North Carolina, la University of Minnesota y el Wuhan Institute of Virology (Two Mutations Were Critical for Bat-to-Human Transmission of Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus).

Sitio de escisión polibásico furin único de COVID-19

Con base en la evidencia científica disponible, el virus COVID-19 (SARS-CoV-2) fue el producto de una investigación de "ganancia de función", no una transmisión natural de huéspedes animales a humanos.

La investigación de ganancia de función se define como cuando un virus natural es manipulado genéticamente o de otra manera para hacerlo más contagioso, más letal o ambos.

Solo hay dos razones para realizar una investigación de ganancia de función, (1) para comprender las características estructurales y las acciones de un virus con el fin de crear una vacuna en previsión de un posible brote de una nueva enfermedad o (2) para crear un arma biológica, o ambas cosas.

El camino que conduce a la pandemia de COVID-19 comenzó durante la primera pandemia de SARS (síndrome respiratorio agudo severo), mucho menos extendida y mortal que la de 2002-2004 (SARS-CoV-1), que también se originó en China.

Es importante tener en cuenta que antes del brote de SARS de 2002-2004, el PLA chino consideraba en gran medida al coronavirus como una enfermedad veterinaria, particularmente en los perros de trabajo.

Después del inicio de la pandemia de SARS de noviembre de 2002 que se originó en Foshan (Guangdong, China) el PLA jugaría un papel enorme en la investigación del coronavirus humano.

Gran parte del esfuerzo del PLA durante e inmediatamente después de la pandemia de SARS de 2002-2004 se centraría en la Third Military Medical University en Chongqing, parte del Nanjing Military Command.

Después de 2009, las publicaciones de esa institución que involucraban a los coronavirus pasaron a la clandestinidad, prácticamente desapareciendo, solo para resurgir de manera prominente en la controversia sobre el origen del COVID-19.

Cuatro jugadores clave en la saga COVID-19, ya sea trabajando o teniendo conexiones con la Third Military Medical University del PLA en Chongqing fueron los científicos chinos entrenados por el ejército Bing Ni, Yuzhang Wu, Guangyu Zhao y Yusen Zhou.

Los dos últimos, a través de su asociación con Shibo Jiang, serían fundamentales para abrir los programas de investigación sobre coronavirus en China a los vastos recursos de los laboratorios estadounidenses y la financiación federal.

Durante ese brote inicial de SARS y continuando con la pandemia de COVID-19, se llevó a cabo una amplia ganancia de funciones e investigaciones relacionadas tanto en los EEUU como en China, a veces por el propio PLA.

Científicos chinos que trabajaban en laboratorios estadounidenses llevaron a cabo una gran cantidad de experimentos con coronavirus, muchos de los cuales fueron financiados por contribuyentes estadounidenses, especialmente a través del NIAID de Fauci.

Al hacer coincidir las características únicas del virus COVID-19 con la investigación realizada por esos científicos, en esas instituciones, a menudo en colaboración, se puede construir una hoja de ruta que conduzca a la pandemia.

El virus COVID-19 tiene una serie de características estructurales inusuales que no se pueden explicar fácilmente como productos de un proceso evolutivo normal.

La característica estructural más distintiva y única del virus COVID-19 es el sitio de escisión polibásico de furina.

La presencia y la importancia de los sitios de escisión polibásica en el ciclo de vida de los coronavirus son bien conocidas desde la década de 1980.

Es ampliamente conocido que la furina y otros sitios de escisión de proteasas aumentan tanto la infectividad como la patogenicidad de los coronavirus.

La glucoproteína de "pico" del coronavirus se une a la célula humana e inicia la fusión de virus a células, lo que permite que el virus se apropie de las capacidades sintéticas de la célula para replicarse.

El pico del virus COVID-19 tiene dos componentes principales. El componente S1 del pico contiene el dominio de unión al receptor (RBD) que se une al receptor de la enzima convertidora 2 de angiotensina humana (ACE2), mientras que el segmento S2 del pico contiene el elemento regulador de la fusión.

En la unión S1-S2 hay un sitio de escisión polibásico de furina, que es responsable de separar las secciones S1 y S2 y facilitar la fusión con la célula.

El sitio de escisión polibásico del virus COVID-19 es una secuencia corta de los aminoácidos prolina-arginina-arginina-alanina-arginina-serina o "PRRARS", donde la escisión ocurre entre R y S con las argininas básicas precedentes acelerando la reacción.

Aunque el segmento R-S está presente en muchos coronavirus, no existe un origen natural identificado para la secuencia PRRA. Ninguno de los coronavirus de murciélago estrechamente relacionados tiene tal estructura en esa posición y los nucleótidos genómicos que lo codifican, una secuencia doble de citosina-guanina-guanina o CGG-CGG, es extremadamente raro.

Es mucho más probable que la secuencia PRRA del sitio de escisión polibásica de furina de COVID-19 se haya insertado artificialmente.

Experimentos que pueden haber llevado a la presencia del sitio de escisión polibásico de furina de COVID-19

En 2004, durante la primera pandemia de SARS, se presentó una patente importante titulada "Insertion of Furin Protease Cleavage Sites in Membrane Proteins and Uses Thereof" (US7223390B2 - Insertion of furin protease cleavage sites in membrane proteins and uses thereof - Google Patents).

Hasta el día de hoy, solo ha habido veintitrés citas científicas de esa patente. Una de ellas es de Shibo Jiang y su colega de entrenamiento militar chino Shuwen Liu.

En 2005, Shibo Jiang junto con sus colegas Yuxian He y Yusen Zhou del Laboratorio State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity, Institute of Microbiology and Epidemiology de Beijing, Academy of Military Medical Sciences (Beijing, China) declararon que no se observó división entre el S1 y componentes S2 del primer virus del SARS (Receptor-binding domain of severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein contains multiple conformation-dependent epitopes that induce highly potent neutralizing antibodies - PubMed).

En 2007, el mismo grupo de investigadores militares dirigido por Shibo Jiang concluyó que la escisión, de hecho, ocurrió en el primer virus del SARS y se correlacionó con la infectividad (Cleavage of spike protein of SARS coronavirus by protease factor Xa is associated with viral infectivity - PubMed).

En 2009, un grupo de investigación de la Cornell University confirmó la correlación entre los sitios de escisión y la infectividad del SARS (Activation of the SARS coronavirus spike protein via sequential proteolytic cleavage at two distinct sites).

Luego, en 2013, llegó lo que muchos podrían considerar la prueba irrefutable.

A pesar de tener el título inocuo "Simultaneous Expression of Displayed and Secreted Antiboodies for Antibody Screen", Shibo Jiang y su colega Shuwen Liu, entrenado en el ejército, demostraron la inserción artificial de un sitio de escisión polibásico de furina similar al encontrado en el virus COVID-19 (Simultaneous expression of displayed and secreted antibodies for antibody screen - PubMed).

Ese estudio fue financiado directamente por el gobierno chino y una empresa privada de biotecnología china, mientras que Shibo Jiang también fue financiado por el NIAID de Fauci.

Quizás por coincidencia, entre 2012 (Expression of B and T lymphocyte attenuator (BTLA) in macrophages contributes to the fulminant hepatitis caused by murine hepatitis virus strain-3 | Gut) y 2020 (Progress and Prospects on Vaccine Development against SARS-CoV-2), Lixin Zheng, un científico que trabajaba en los propios laboratorios del NIAID de Fauci, estaba realizando una investigación conjunta (https://aasldpubs.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/hep.27114) con la Third Military Medical University del PLA (Chongqing, 400038, China) (VSIG4 inhibits proinflammatory macrophage activation by reprogramming mitochondrial pyruvate metabolism - PubMed).

La Third Military Medical University del PLA en Chongqing ha sido considerada durante mucho tiempo un punto focal de la investigación del coronavirus.

 

[Despistado3 (versión3.0)]

Continuación.

14.02.2021

Escribe Lawrence Sellin, un coronel retirado del ejército de los EEUU.

The Chinese Military, its Links to U.S. Funding and the Laboratory Origin of COVID-19
El ejército chino, sus vínculos con la financiación estadounidense y el origen de laboratorio de la COVID-19

Traducción paco-Google.

El ejército chino, sus vínculos con la financiación estadounidense y el origen de laboratorio de la COVID-19

Spoiler

El denunciante chino, el Dr. Li-Meng Yan, afirma que el virus COVID-19 se originó en laboratorios supervisados por el PLA chino (Unusual Features of the SARS-CoV-2 Genome Suggesting Sophisticated Laboratory Modification Rather Than Natural Evolution and Delineation of Its Probable Synthetic Route), utilizando los coronavirus de murciélago ZC45 y/o ZXC21 recolectados en Zhoushan (China) y utilizados como la "columna vertebral" viral para la ingeniería genética.

Esos coronavirus de murciélago se aislaron y caracterizaron originalmente entre julio de 2015 y febrero de 2017 bajo la supervisión de la Third Military Medical University en Chongqing (China) y el Research Institute for Medicine del Nanjing Military Command del PLA.

Shibo Jiang ha colaborado con el Nanjing Military Command del PLA (Pathogenic Streptococcus strains employ novel escape strategy to inhibit bacteriostatic effect mediated by mammalian peptidoglycan recognition protein - PubMed) y el Wuhan Institute of Virology tiene vínculos de varios niveles con el PLA (Virus-like particles of SARS-like coronavirus formed by membrane proteins from different origins demonstrate stimulating activity in human dendritic cells - PubMed) y ambos están conectados entre sí (Cross-neutralization of SARS coronavirus-specific antibodies against bat SARS-like coronaviruses).

* Nota agregada a continuación por el autor el día después de la publicación inicial:

Un escenario para el inicio de la pandemia podría haber sido una liberación directa accidental del virus COVID-19 desde el Wuhan Institute of Virology.

Otra posibilidad implica un accidente relacionado con el desarrollo de una vacuna.

Muchas vacunas contienen virus vivos, pero "atenuados", es decir, virus debilitados insuficientes para causar una enfermedad, pero lo suficientemente similares a una infección real para iniciar una respuesta inmune y la producción de anticuerpos.

Las vacunas vivas atenuadas se utilizan para enfermedades infantiles como el sarampión, las paperas, la rubéola y la varicela. Debido a que las vacunas vivas atenuadas son tan similares a la infección natural, producen una respuesta inmune fuerte y duradera, incluso de por vida.

Las vacunas vivas atenuadas también pueden ser menos costosas y producirse más rápidamente, pero pueden ser riesgosas si el virus atenuado "revierte" a su estado patógeno.

Durante la pandemia de SARS 2002-2004, el Wuhan Institute of Virology realizó pruebas de una vacuna inactivada contra el virus del SARS en monos rhesus (Immunogenicity, safety, and protective efficacy of an inactivated SARS-associated coronavirus vaccine in rhesus monkeys).

Es posible que la pandemia de COVID-19 comenzara cuando una vacuna viva atenuada para el virus COVID-19 creado en laboratorio volvió a su estado patógeno en individuos presuntamente inmunizados o animales de laboratorio.

 

[Despistado3 (versión3.0)]

Hoy, un "tertuliano-humorista" en el programa de "las mañanas de TVE" (no sé si se denomina exactamente así) ha comparado no querer ponerse la vacuna con hacer puenting sin cuerda por miedo a que la cuerda se rompa. Lo ha dicho en plan cachondeo pero igualmente me ha resultado inquietante. Póntela, póntela, póntela. A juzgar por lo que se va viendo parece que la popularidad de las vacunas no pasa por su mejor momento.

 

[Despistado3 (versión3.0)]

Recordemos allá por noviembre de 2019.




El evento contó con la presencia de Adrian Thomas, de Johnson & Johnson.

Spoiler

Ahora es el momento de la vacuna de Janssen, filial de Johnson & Johnson.

Mañana, la multinacional logística UPS, que también estuvo presente en el famoso evento, distribuirá masivamente vacunas por África a través de sistemas de drones.